黑沙蒿黄酮抗氧化性能的构效关系分析

2022-09-27杨怡萌姜显琼陈聪梅

四川师范大学学报（自然科学版） 2022年5期

杨怡萌, 黎可, 姜显琼, 陈聪梅, 王强*

(1. 重庆第二师范学院生物与化学工程学院, 重庆 400067; 2. 重庆第二师范学院脂质资源与儿童日化品协同创新中心, 重庆 400067;3. 国家超级计算深圳中心, 深圳 518055)

黑沙蒿为菊科植物,全草均可入药[1],具有抗氧化、降血糖、降胆固醇、消炎止血等药用功效[2].黑沙蒿主要含有多糖类、黄酮类、挥发油类和三萜类物质,其中黄酮类化合物是发挥抗氧化作用的主要活性成分[3].现有文献表明,黄酮类化合物的抗氧化作用主要通过氢转移机制得以实现[4-7],即黄酮化合物中的酚羟基与自由基发生抽氢反应生成较稳定的半醌式自由基,从而终止自由基链式反应,起到抗氧化的作用.然而,由于自由基作为高活性中间体在实验过程中很难捕捉,使得单一通过实验手段进行抗氧化机理的深入研究受到了限制.换句话说,从分子水平对黑沙蒿黄酮类化合物通过清除自由基发挥抗氧化活性的作用机制仍然有待进一步研究.

近年来,实验工作者采用不同的实验手段对黑沙蒿等黄酮类化合物的自由基清除活性进行探索研究,如DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除活性测定法[8]、ATBS测定法[9]以及羟基/超氧阴离子自由基清除法[10-11]等.王勇等[12]以IC50值作为评价指标,采用分光光度法研究了黑沙蒿中黄酮类化合物清除·OH自由基的活性,并初步探讨了黑沙蒿黄酮清除羟基自由基活性与结构之间的关系.Asres等[13]通过纵向对比不同类别的黄酮类化合物结构及DPPH自由基清除活性,发现黄酮化合物的分子结构直接决定了抗氧化活性的高低.不难看出,黄酮的分子结构与其抗氧化性能之间具有明显的相关性,但是,单一的实验研究中多数缺乏定量的理论解释来具体阐明结构与活性之间的关系以及抗氧化活性的内在规律.

量子化学计算的快速发展为深入探索黑沙蒿黄酮抗氧化活性构效关系提供了便捷,例如,齐婧敏等[14]基于密度泛函理论,采用B3LYP方法对黑沙蒿黄酮化合物进行气相优化,并对其抗氧化作用进行了分析.注意到B3LYP方法的经典毋庸置疑,然而近年的研究中,科研工作者发现其计算精确度不够理想[15-16],而M06-2X[17-18]密度泛函方法在黄酮类化合物的自由基清除活性计算中备受好评,例如Li等[19]运用密度泛函M06-2X方法对比分析了13种黄酮化合物结构与抗氧化活性的关系,通过羟基O—H键解离能的计算揭示了氢转移机制是黄酮发挥抗氧化作用的优势路径,并且计算值与实验值保持较高的一致性.

实验及量子化学计算的方法在黄酮类化合物抗氧化活性的研究中发挥着同样重要的作用,考虑到不同计算方法的差异性以及溶剂化效应的影响,本文运用M06-2X密度泛函方法进行溶剂相优化,对4种黑沙蒿黄酮的抗氧化活性进行深入分析,在优化结构分析、抽氢反应的热力学能量分析、NBO电荷分析的基础之上,本文首次采用Multiwfn软件[20]对黑沙蒿黄酮的自由基稳定性进行评价,通过自旋密度图和酚羟基氧原子上的自旋密度值形象化对调控黄酮自由基稳定性的因素进行阐释.最后,针对不同溶剂的极性对黑沙蒿黄酮抗氧化性能的影响也进行了探索分析.希望通过本文的研究,提出调控黑沙蒿黄酮抗氧化性能的关键活性位点及分子结构-抗氧化性能关系的内在规律,同时为量子化学计算在天然黄酮抗氧化活性的构效关系的探索中提供新的分析角度和思路,为天然黄酮抗氧化性能的深入研究与应用提供理论依据.

1 计算方法

本文中所有的密度泛函计算结果都是在Gaussian 09上运行[21],考虑到M06-2X方法在计算分子弱相互作用时精密度更高[22],以及近年来在黄酮化合物计算中被广泛应用,因此针对4种黑沙蒿黄酮,采用M06-2X方法在全电子基组6-31G(d)水平下,以SMD[23]为溶剂模型,以甲醇为溶剂进行结构优化,频率的计算用于确定虚频的数量,中间体的虚频数为0.文中各物质的热力学能量描述用焓值表示.

基于黑沙蒿黄酮分子的优化结构计算模拟,本文通过几何构型参数分析、抽氢反应热力学能量分析、NBO电荷分析、黄酮自由基稳定性分析对黑沙蒿黄酮抗氧化活性的构效关系进行探究,并针对不同的溶剂(水、甲醇、乙醇)极性对黑沙蒿抗氧化活性的影响也进行了对比分析,深入探讨黑沙蒿黄酮抗氧化活性的构效关系及内在规律.其中,黄酮半醌式自由基的自旋密度图是在Multiwfn软件[20]下得到的.

2 结果与讨论

2.1 优化结构参数分析现有文献表明,黑沙蒿黄酮种类较多[3,24-25],本文选择4种具有代表性的黄酮分子(芫花素、羟基芫花素、芹菜素-7,4′-二甲醚、鼠李素),其分子结构如图1所示,其中,黄酮ABC环对应的位置如图1(a)所示.

根据黄酮类化合物的抗氧化作用机制,抗氧化性能的高低由酚羟基的O—H键断裂发生抽氢的难易程度来决定,因此,酚羟基的O—H键长是评价其抗氧化活性的关键结构因素,4种不同黑沙蒿黄酮的优化结构如图2所示,优化结构参数如表1所示.

图2 黑沙蒿黄酮化合物的优化结构示意图

表1 4种黑沙蒿黄酮化合物的酚羟基O—H键键长及∠C—O—H键角

分析不同黑沙蒿黄酮分子的酚羟基O—H键,从表1中可以发现,不同黄酮分子的酚羟基O—H键长相差不大,主要分布在0.096 7～0.098 3 nm之间.其中,鼠李素C3上的O—H键最长(0.098 3 nm),再横向对比C4′、C5、C3′位点酚羟基O—H键长与其他4种黄酮化合物相差不大,另外,考虑到鼠李素的羟基数最多,初步推测鼠李素的抗氧化活性较高.以同样的思路,不难发现,羟基芫花素具有3个酚羟基活位点,且C3′羟基的键长与芫花素和芹菜素-7,4′-二甲醚中任意键长相比更长(0.097 1 nm对0.096 8 nm),因此,根据酚羟基O—H键长的数据对比,初步认为4种黑沙蒿黄酮的抗氧化活性高低依次为:鼠李素>羟基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚.

再次对比不同黑沙蒿黄酮分子的酚羟基C—O—H键角(表1),发现大多数的键角是介于108°～110°范围内,其中鼠李素C3—O—H的键角(103.4°)及羟基芫花素、鼠李素的C3′—O—H键角(约107°)相对较小,分析可能是由于鼠李素C3位点羟基中的氢原子与相邻羰基中电负性较大的氧原子形成了弱的氢键作用(如图2虚线所示)造成的.同样地,鼠李素和羟基芫花素C3′的羟基与C4′羟基中的氧原子也可以通过形成分子内氢键,使得C3′位点的O—H键被有所拉长,C3′—O—H键角有所压缩.

2.2 抽氢反应的热力学能量分析根据黄酮类化合物抗氧化作用机制,抽氢反应的难易程度还可以从热力学角度进行分析,以实验测定常用的DPPH自由基为捕获对象,对4种黄酮分子(Fl—OH)与DPPH·在甲醇溶剂下发生抽氢反应[21-23](Fl—OH+DPPH·=Fl—O·+DPPH2)的反应焓变进行计算分析,结果如表2所示.可以看出,抽氢反应为吸热过程,因此,该过程所需能量越低,代表反应越容易发生,自由基清除活性越高.

从表2中数据可以得出以下结论:1) B环邻位双羟基的存在对抗氧化性能的提升影响显著.通过对比4种黑沙蒿黄酮,发现鼠李素、羟基芫花素均含有3′,4′-双羟基结构,当C4′位点H原子解离后,自由基氧原子具有较高的电负性,与相邻羟基中的H原子可以形成分子内氢键,大大增加了产物自由基的稳定性,使得鼠李素和羟基芫花素的C4′位点抽氢反应焓较低(66.18和73.80 kJ/mol);另一方面,对于失去邻位双羟基结构的芫花素而言,其C4′位点的抽氢反应焓明显增高(106.32 kJ/mol),进一步验证了上述结论.2) B环羟基位点抗氧化活性最高,A环活性最低.4种黑沙蒿黄酮在A环上的C5—OH的抽氢反应焓最高(>104 kJ/mol),抗氧化活性最低,而B环中C4′—OH是鼠李素、羟基芫花素、芫花素的最高活性位点.3) 通过羟基位置和数量的综合考虑,根据4种黑沙蒿黄酮抽氢反应焓值的对比分析,得出其活性次序为:鼠李素>羟基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚.这一结论与上文结构参数的结论保持一致,并与齐婧敏等[14]提出的抗氧化活性次序也保持一致.

表2 在甲醇溶剂中4种黑沙蒿黄酮不同羟基位点的抽氢反应焓的计算值

2.3 NBO电荷分析基于热力学能量分析,得出了4种黑沙蒿黄酮抗氧化性能的高低,为了从电子效应分析其内在成因,对黄酮酚羟基H原子的NBO电荷进行了对比,发现黄酮发挥抗氧化性能是通过对自由基的捕获,而这一过程是具有较高的电负性的原子通过与黄酮酚羟基的H原子结合而实现,因此,黑沙蒿黄酮酚羟基H原子的NBO电荷高低是决定其抗氧化活性差异的内在因素.由于自由基的作用位点氧或氮原子呈电负性,黄酮类化合物中酚羟基上的H原子所带正电荷越多(即NBO电荷越高)时,越容易与该类自由基发生结合,它的抗氧化性能越强.于此,运用优化后的分子在M06-2X/6-31G(d)方法下进行单点计算,得到4种黑沙蒿黄酮酚羟基H原子上的NBO电荷分布,如表3所示.

根据表3的数据分析,发现表2中抽氢反应能量越低的羟基位点,H原子的NBO电荷更高.即黑沙蒿黄酮酚羟基上H原子的NBO电荷与抽氢反应焓的高低成反比关系.比如在羟基芫花素中,氢原子的NBO电荷表现为C4′(0.511 4)>C3′(0.509 1)>C5(0.492 2),代表其抽氢反应的活性高低是C4′>C3′>C5,与热力学能量分析结论(73.80比90.29比109.72 kJ/mol)保持一致.同样的,芫花素、芹菜素-7,4′-二甲醚的H原子NBO电荷也与抽氢反应能量的高低成反比关系,芫花素抽氢反应焓值C5位点(110.34 kJ/mol)>C4′位点(106.32 kJ/mol),NBO电荷分布为C5(0.492 2)

表3 4种黑沙蒿黄酮酚羟基H原子上的NBO电荷分布

然而,值得注意的是,在鼠李素中,NBO电荷数最大的是C3号位羟基H原子,与抽氢反应能量最低位点C4′这一结论有所出入,分析原因可能与该位置酚羟基上的H易与邻位的羰基形成分子内氢键,从而使负电荷更多地向羰基离域,使得C3—OH中氢原子的NBO电荷有所升高;另一方面,C3—OH在发生O—H键断裂之后,其半醌式自由基失去了氢键的稳定化作用,使得其从热力学角度上有所升高,而C4′位点在发生O—H键断裂后,其邻位C3′—OH的分子内氢键依然存在,使得C4′位点的半醌式自由基稳定性依然较高,鼠李素最高活性位点的最终提出将结合黑沙蒿黄酮自由基的自旋密度分布情况在下文进行分析.

此外,还发现不同的黑沙蒿黄酮中均表现出B环上羟基活性较高,A环C5—OH活性最低(约0.49),与上文抽氢反应焓的结论保持一致,造成这一结果的原因可能是黑沙蒿黄酮分子中C环均含有不饱和羰基,它的存在一方面增强了B环的共轭作用,另一方面由于不饱和羰基的吸电子特性钝化了A环上的羟基活性,而对B环的钝化作用则不明显.

2.4 自旋密度分析黄酮类化合物自由基清除活性不仅取决于黄酮分子中羟基位点的给氢难易程度,更取决于产物黄酮自由基的稳定性,单电子自旋密度分布是评价自由基稳定性的重要指标.基于黑沙蒿黄酮分子优化结构的单点计算,运用Multiwfn软件[20]得到了4种黑沙蒿黄酮自由基的自旋密度分布图.图3显示了自由基结构中单电子的分布情况,而每一个原子上所标出的数值,是对应自旋密度大小(Alpha电子密度-Beta电子密度).

为了清晰可见,以鼠李素为例,对比了不同羟基位点发生抽氢反应后半醌式自由基的自旋密度图,如图3所示.根据上文鼠李素的抽氢反应焓值和不同羟基H原子的电荷分布,发现C4′—OH相对于C3—OH位点表现出略低的反应焓(66.18比70.83 kJ/mol),但NBO电荷分析中却表现出C3—OH位点的氢原子的电荷更正(0.510 0比0.523 5),这一矛盾促使对鼠李素这2个位点的半醌式自由基的稳定性差异先进行剖析.通过自旋密度图发现,鼠李素—C4′—自由基(图3(b))和鼠李素—C3—自由基(图3(c))中单电子在B和C环均有离域,但是前者的离域程度更高,这一结论可以从羟基氧原子的自旋密度值得以验证;从鼠李素C4′—OH上的氢发生解离后,自旋密度远远小于C3—OH上氧原子的自旋密度值(0.290比0.313),说明鼠李素—C4′—自由基单电子更多地从氧原子上离域到了相邻原子上,使得自旋密度分布更加分散,自由基稳定性更高.分析其内在成因,可能是鼠李素C4′—OH在抽氢之后,与相邻的C3′形成的分子内氢键的稳定化作用造成的.因此,认为鼠李素的最高活性位点是C4′—OH,最高活性位点的提出要结合热力学分析以及自由基产物的稳定性进行综合评判.

图3 鼠李素半醌式自由基的自旋密度分布图

此外,还发现鼠李素4个不同羟基位点自由基中酚羟基氧原子的自旋密度数值高低次序为;C4′(0.290)

以同样的研究思路,分别提出了其他3种黑沙蒿黄酮的最高活性位点,如图4所示.为了清晰可见,将4种黑沙蒿黄酮的最高活性位点的自旋密度图进行对比分析,结果发现,4种黑沙蒿黄酮最高活性位点对应的自由基氧原子的自旋密度从低到高分别为;鼠李素C4′位点0.290(图3(b))、羟基芫花素C4′位点0.304(图4(a))、芫花素C4′位点0.337(图4(b))、芹菜素-7,4′-二甲醚C5位点0.564(图4(c)),该数值越低,即单电子离域越明显,半醌式自由基稳定性越强,抗氧化活性越高,换句话说,黑沙蒿黄酮自由基氧原子的自旋密度分布与抗氧化性能成反比关系.

图4 最高活性位点半醌式自由基自旋密度分布图

此外,不难发现该趋势与上文通过结构参数和热力学能量分析提出的4种不同黑沙蒿活性位点的高低次序保持一致,即鼠李素>羟基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚,同样含有分子内氢键的鼠李素和羟基芫花素活性较高,说明分子内氢键是调控黑沙蒿黄酮自由基稳定性及抗氧化性能的关键结构因素,B环4′—OH是黑沙蒿黄酮的关键活性位点.

基于自旋密度的对比研究,认为通过自旋密度分布判断半醌自由基稳定性这一分析角度,单一黄酮分子中最高活性位点的提出以及不同黄酮分子间最高活性位点的纵向对比均具有重要的理论意义,为从分子水平对黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的分析提供了新思路.

2.5 溶剂极性对黑沙蒿黄酮抗氧化性能的影响分析为了进一步分析不同溶剂极性对黑沙蒿黄酮抗氧化性能的影响,在水、乙醇两种溶剂下,同样运用M06-2X/6-31G(d)方法对黑沙蒿黄酮在与DPPH自由基发生抽氢反应(Fl—OH+DPPH·=Fl—O·+DPPH2)历程的焓值进行了计算分析,结果如表4所示.为了清晰可见,将甲醇溶剂下的抽氢反应焓(表2)与水、乙醇溶剂下的焓值(表4)进行对比,并绘制成折线图,不同颜色的曲线代表不同的溶剂下能量数据,如图5所示.

图5 不同溶剂下黑沙蒿黄酮的抽氢反应焓值对比图

水(H2O)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)溶剂极性依次降低,根据表4和图5的对比分析中,可以更加清晰地看出;在3种溶剂中各位点抽氢反应焓值高低次序为,圆形曲线(水)>方形曲线(甲醇)>三角形曲线(乙醇),即随着溶剂的极性减弱有利于黑沙蒿黄酮抗氧化性能的提升,这一结论与前人采用密度泛函理论研究黄芪黄酮[26]、白藜芦醇[27]中溶剂极性对抗氧化活性影响的结论保持一致.此外,还发现溶剂化效应的影响并未改变4种黑沙蒿黄酮的抗氧化次序以及最高活性位点的提出.即抗氧化次序依旧是鼠李素>羟基芫花素>芫花素>芹菜素-7,4′-二甲醚,其中B环的C4′位点依然是黑沙蒿黄酮的最高活性位点.