云南中甸地区3个牛种PRNP基因23 bp和12 bp位点的InDel多态性与表达水平

和晓明，Sameeullah MEMON，刘兴能，岳 丹，邓卫东，席冬梅*

(1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业职业技术学院，云南 昆明 650031)

牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)，也被称为“疯牛病”，是一种发生在牛上的传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)，自英国暴发后传遍了英国的牧场，并进入食物链，严重威胁着人类健康。BSE是具有传染性和遗传性的致命神经退行性疾病，由异常折叠的朊病毒(protease-resistant infectious protein, PrP)诱导宿主中正常和非感染性的朊蛋白(cellular prion protein, PrP)转化为非正常和传染性的致病性PrP朊病毒构象。研究表明，敲除PrP的转基因小鼠可以抵抗朊病毒，动物体内PrP减少可以抵抗BSE。在正常生物体内PrP是一种高度保守并广泛表达的糖蛋白，介导细胞增殖、分化和恶性变异，干预多条与肿瘤形成有关的信号通路，若完全缺失PrP可能会带来一些副作用。编码PrP的基因是个高度保守的基因，不同物种间的PrPmRNA序列不相同，甚至同一物种的不同个体中PrP氨基酸序列也有差别，众多研究认为人和多种动物TSEs的发生与基因多态性有关。第1内含子12 bp序列和启动子区23 bp序列的插入/缺失(InDel)多态性影响着基因的转录和翻译，12 bp InDel与转录子SP1相关，23 bp InDel与转录因子阻遏蛋白58(RP58)相关，这两位点的插入/缺失多态与BSE的抗性(或易感性)显著相关。报告基因分析显示两个假定的转录因子之间的相互作用，等位基因23 bp插入(insertion，ins(+))/12 bp缺失(deletion，del(-))的表达水平低于23 bp del/12 bp del，12 bp del导致表达水平显著降低，有这些缺失的牛，因缺乏其各自调控元件的结合位点，更容易感染经典的BSE。本研究通过比较云南中甸3种地方品种牛基因12 bp和23 bp位点的InDel多态性，以及对延髓组织中基因mRNA的表达量测定，进一步对中甸地区牛BSE的易感性进行分析，为牛的抗病育种提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

562头中甸牦牛、377头中甸犏牛和368头中甸黄牛的DNA样品采自迪庆州香格里拉市屠宰场。动物组织DNA提取试剂盒、2×PCR Mix和反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，Ⅱ内切酶购自Fermentas公司，总RNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 PCR扩增

DNA提取试剂盒提取3种牛样本中的总DNA，取1 μL进行PCR扩增，采用全式金的2×PCR Mix反应体系进行扩增。PCR反应体系总体积为20 μL(1 μL样本、17 μL Mix、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL)；样品94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min、56(12 indel)/58(23 indel)℃退火45 sec、72 ℃延伸1 min的条件下进行38个循环，反应完后在72 ℃延伸7 min，整个体系反应结束后4 ℃保存。每个样品都电泳检测或送出到生工(上海)生物公司进行测序。将获得的目的序列与GenBank上的序列进行比对并分型。PCR引物见表1。

表1 各基因PCR引物及相关信息

1.3 PRNP基因23 bp和12 bp等位基因插入/缺失多态检测

1.3.1 第1内含子区域12 bp插入/缺失的多态鉴定基因第1内含子区域12 bp目的基因短不易电泳判断，该区域内有1个Ⅱ限制性内切酶的识别位点5'-CCGC↓GG-3'，故采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，对扩增的目的片段酶切处理，消化切割成不同大小片段。酶切产物的电泳检测：用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测(120 V，1 h)和凝胶成像仪拍照并分析条带，统计结果，对第1内含子区域12 bp插入/缺失进行分型。

1.3.2 启动子区域23 bp插入/缺失的多态鉴定 对基因启动子区域23 bp的PCR产物采用3%琼脂糖凝胶电泳检测(60 V，3 h)，凝胶成像仪拍照并分析条带，统计结果，进行启动子区域23 bp插入/缺失多态性的分型。电泳无法分析的PCR产物样品送至生工(上海)生物工程测序。

1.4 实时荧光定量PCR

建立基因和基因标准曲线。反应体系组成见表2，混匀离心后的反应物在Bio-RadiCycler荧光定量PCR仪上进行Real Time PCR反应，以拟合标准曲线。进行溶解曲线分析，抽取荧光定量PCR产物进行电泳分析其多态性，判断反应产物是否是目的条带，有无引物二聚体。反应程序：95 ℃ 30 sec；95 ℃ 5 sec，57 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，40个循环。

表2 实时荧光定量反应体系

2 结果与分析

2.1 朊蛋白基因23 bp和12 bp插入/缺失的检测

基因启动子区域23 bp插入/缺失相差23个碱基，缺失纯合基因型在130 bp处有1个条带，插入纯合基因型条带在153 bp处，杂合基因型在130 bp和153 bp处各有1个条带(图1A)；第1内含子区域12 bp缺失纯合基因型在414 bp处有条带，插入纯合基因型被酶切后在276 bp和150 bp各1个条带，杂合基因型在414、276 bp和150 bp处各有1个条带(图1B)。

图1 PRNP基因23 bp(A)、12 bp(B)插入/缺失的电泳检测

基因23 bp和12 bp序列图的峰值单一，且基因23 bp插入、23 bp缺失、23 bp杂合、12 bp插入、12 bp缺失和12 bp杂合缺失6种基因序列特征明显(图2)。

图2 23 bp(A)和12 bp(B)插入/缺失的序列检测

2.2 朊蛋白基因23 bp和12 bp插入/缺失的基因频率和基因型频率

中甸牦牛的23 bp indel缺失纯合(-/-)基因型频率最高(0.838)，插入等位基因频率极低，中甸犏牛(0.467)和黄牛(0.399)的缺失基因型(-/-)频率也高于插入纯合(+/+)和杂合(+/-)基因型频率，中甸牦牛缺失等位基因频率(0.91)显著高于中甸犏牛(0.588)和中甸黄牛(0.594)；而在12 bp InDel中，3种牛的最高基因型频率为插入纯合(+/+)，缺失等位基因频率均较低(表3)。结果表明在3种牛中23 bp 的缺失和12 bp的插入比例较高，频率基本呈现出中甸牦牛>中甸犏牛>中甸黄牛的现象。

表3 牛23 bp和12 bp插入/缺失的基因频率和基因型频率

2.3 朊蛋白基因23 bp和12 bp插入/缺失的单倍型构建

采用SHEsis软件包(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)对启动子区域的23 bp和第1内含子区域的12 bp多态位点进行单倍型构建，结果表明，3种中甸地方牛中杂合的单倍型频率较高，中甸牦牛和中甸犏牛单倍型均以2312为主，频率为0.794和0.444，而中甸黄牛为2312，频率为0.434；中甸犏牛和中甸黄牛的次要单倍型为2312，频率为0.392和0.332，所占的比例也较高(表4)。

表4 牛PRNP基因23 bp和12 bp位点插入/缺失单倍型频率

2.4 PRNP mRNA在3种牛延髓组织的表达

RNA提取物28S、18S和5S 3条带均清晰，RNA条带未降解无DNA污染(图3)，RNA百倍稀释后，总RNA浓度在0.9 g/L以上，所提取的RNA有较好的纯度和浓度。RT-PCR扩增结果，除目标条带之外没有非特异性条带，没有引物二聚体，且目的条带清晰明亮，说明参与反应的模板质量很好，基因和基因的引物设计、合成准确，反应条件已优化到最佳。

图3 部分样品总RNA点样图片

在分别对中甸牦牛、中甸犏牛和中甸黄牛这3种牛的不同性别、年龄、毛色的延髓组织基因表达量检测后，结果表明不同性别、年龄和毛色牛延髓组织中基因的mRNA表达量不存在显著差异(>0.05)(表5)。

表5 不同性别、年龄和毛色牛中延髓组织PRNP基因的表达

对3种牛23 bp(表6)和12 bp(表7)InDel基因型的基因mRNA表达量测定结果表明，23 bp缺失基因型(-/-)在3种牛基因mRNA表达量最高，23 bp的缺失增加了PRNP表达；而在12 bp中，缺失基因型(-/-)在中甸牦牛表达量最高，在中甸犏牛中杂合基因型(+/-)表达高，而在中甸黄牛中12 bp插入基因型(+/+)表达量最高。但由于样本数量差异较大，故标准差()较大，统计结果显示23 bp +/-基因型对在延髓的表达量差异均不显著(>0.05)。

表6 23 bp插入/缺失基因型对3种牛PRNP基因mRNA表达量的影响

表7 12 bp插入/缺失基因型对3种牛PRNP基因mRNA表达量的影响

由表8可以看出，中甸牦牛中--/--单倍型的表达量高，中甸犏牛中+-/--单倍型表达量高，中甸黄牛+-/+-单倍型表达量高。由于标准差(SD)较大，23 bp和12 bp插入/缺失位点组成的单倍型在延髓的表达量差异不显著(>0.05)，在中甸黄牛中有+-/++和--/+-这两个中甸牦牛和犏牛没有的单倍型。

表8 不同单倍型对PRNP基因在3种牛延髓组织中mRNA表达量的影响

3种牛23 bp和12 bp的不同基因型和单倍型之间的mRNA表达量差异均不显著(>0.05)，可能与不同基因型mRNA表达量测定时获得的样品量差异太大有关。但中甸牦牛的23 bp和12 bp及中甸犏牛和中甸黄牛的23 bp均表现为插入基因型的mRNA表达量低于相关缺失基因型，同时中甸牦牛的单倍型++/++的表达量也低于--/--。这与家养牛关于23 bp纯合子插入基因型通过降低的表达可以增加对BSE的抗性的趋势一致。因此可以利用23 bp和12 bp的插入缺失多态位点来评价非家养牛的BSE抗性。

3 讨 论

中甸牦牛、犏牛、黄牛是生长于迪庆藏族自治州的优良地方品种，能良好适应高海拔、气候寒冷环境，有较强的抗病力。本研究通过分子克隆技术和酶切技术，鉴定中甸牦牛、中甸犏牛、中甸黄牛基因启动子区域23 bp和第1内含子区域12 bp的InDel多态，同时对3种牛的基因表达量进行分析验证，检测3种中甸地方品种牛性别、年龄、毛色的延髓组织内基因表达变化，结果表明所有检测样品获得的标准S形曲线C值无显著差异，说明延髓组织中PrPmRNA表达量在不同性别、年龄、毛色牛中差异不显著。

以往研究表明，12 bp插入和23 bp插入多态性都增加了对BSE抗性，健康牛的23 bp插入高于感染BSE的牛，12 bp和23 bp缺失的等位基因、基因型和12del-23del单倍型与典型的BSE易感性增加有关。在土耳其3种地方品种牛研究中发现12 bp InDel高频率的插入与BSE的低易感性有关。尽管样本数量不同，许多品种牛中12 bp和23 bp 缺失的等位基因频率较高，日本荷斯坦牛的缺失频率最高，12 bp为74%，23 bp在79%。波兰荷斯坦奶牛中缺失频率也较高12 bp为54%，23 bp为63%。相反的是，在水牛的研究中，12 bp和23 bp InDel的缺失等位基因频率异常的低，在BSE暴发的欧洲也没有报道过感染BSE的水牛，认为水牛因12 bp和23 bp高插入等位基因频率，对BSE有较高抗性。在本研究中，中甸牦牛的23 bp缺失基因型(-/-)频率最高(83.8%)，其次是中甸犏牛(46.7%)和中甸黄牛(39.9%)；而在12 bp InDel中，中甸牦牛(76.7%)插入基因型(+/+)频率最高，中甸犏牛71.4%，中甸黄牛62.1%。与Qing等对南阳牛的研究结果相似，在南阳牛中，23 bp InDel缺失纯合基因型(-/-)的个体占优势，12 bp InDel插入纯合基因型(+/+)的个体较多，并认为23 bp的缺失削弱了RP58与启动子的结合，12 bp InDel插入可以通过结合Sp1增强的高表达，23(-/-)12(+/+)基因型可能增强表达。

基于单倍型的方法能够更好的捕获突变的原因，单倍型研究可以更好阐明indels和特定性状之间的关系。23ins-12ins单倍型在健康的瑞士牛中出现的频率为46%，在感染BSE的牛中出现的频率为37%。BSE抗性的单倍型(23ins-12ins)在英国荷斯坦牛的比例为24%，在德国荷斯坦牛的比例为30%，在德国布朗牛的比例为45%，在弗莱克维耶赫牛的比例为27%，在波兰荷斯坦奶牛中比例为27%。赵卉等对中国地方水牛的研究显示水牛以23ins-12ins单倍型为主(92.8%)。在槟榔江水牛中，23ins-12ins单倍型最多，频率为94.5%。大额牛中，23del-12del单倍型低于水牛和牦牛，认为大额牛比起水牛和牦牛更能抵抗BSE。12 bp缺失的等位基因和23del-12del单倍型均在受感染的动物中更常见。认为单倍型23del-12del与BSE的发病率有关，在普通牛中很常见，而在印度尼西亚、泰国牛和水牛中23ins-12ins是主要的单倍型，对典型BSE的易感性较低。由于23del-12ins和23ins-12ins单倍型都与BSE抗性同等相关，12 bp InDel被认为是BSE抗性的基本组成。一些研究表明，23 bp InDel是影响BSE易感性的主要因素，而一些研究表明12 bp的InDel是主要因素。整体上认为，PrP表达水平低的牛在抗BSE方面具有优势，增加12 bp和23 bp插入等位基因的频率将提高对BSE的抗性。

除了控制疾病，基因突变还影响着健康反刍动物的生产性状，如乳用性状、繁殖性能、生长性状。因此，可通过对多态性位点选择来加快经济育种的进程。本研究揭示了3种基因型、6种单倍型在3种牛中的比例和趋势，这些结果可能有助于了解地方品种牛基因的遗传特征，分析这3种牛的抗病力，为培育抗BSE牛提供理论依据和分子标记。

4 结 论

本研究中，中甸牦牛、中甸犏牛和中甸黄牛的23 bp InDel缺失等位基因频率和基因型频率都是最高的，而在12 bp InDel中，缺失等位基因频率和基因型频率均较低；中甸牦牛和中甸犏牛单倍型均以2312为主，中甸黄牛以2312为主，对比以往认为的BSE抗病单倍型2312，可通过育种改良、高效准确的个体筛选，培育出对BSE有较强抗病性的群体，来减少BSE的感染风险。迄今为止，中国尚未发生BSE，但随着中国市场经济的发展、对国际动物及动物产品需求的增长，时刻存在BSE传入的风险，而选择抗性基因型被认为是避免朊病毒病的策略之一，所以开展本病的研究工作，对诊断、鉴别诊断以及防治具有十分重要的意义。