生物除臭剂在生猪养殖场的应用及其急性毒性评价

张英涛，张宗源，冯印印，岳丹丹，安德荣，陈国参*

(1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450000；2.西北农林科技大学 植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100)

据农业农村部统计，猪粪污年产量约18×10t，占畜禽粪污总量的47%。猪粪、猪尿和养殖污水对水、土壤和空气质量均造成不利影响，其中以养殖场粪污产生的臭气污染尤为突出，严重危害到饲养人员、周边居民的日常生活及身心健康，同时也严重危害畜禽健康以及生产能力，臭气治理已经成为生猪养殖业急需解决的关键问题之一。生猪养殖场臭源主要成分有氨气(NH)、硫化氢(HS)等，这些物质易溶于水，当吸附到人和动物呼吸道黏膜，会导致呼吸道疾病和其它病症。目前养殖场除臭方法主要包括化学法、物理法和生物法。由于生物除臭具有高效、环保、低成本、无毒性、无二次污染等优点，越来越多地用在养殖场除臭方面，应用前景广阔。生物除臭法的有效手段是使用微生物除臭剂，微生物除臭剂的关键在于高效除臭微生物的筛选，由于微生物特异性等原因，效果各有差异，如邵栓等选用具有除臭功能的贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和干酪乳杆菌4种微生物菌种复配去除NH和HS；成钢等以新鲜蚯蚓粪为材料筛选出6株具有除NH和HS的微生物用来去除羊粪臭气。俞洁雅等以土壤为材料，通过NH选择性培养基筛到的烟曲霉菌。李玥等以鸡粪堆肥为材料，分离到芽孢杆菌属、贝莱斯芽孢杆菌、耐寒短杆菌、木糖葡萄球菌和变异棒杆菌。这些研究报道大多集中于高效除臭菌株的分离与筛选，实际应用于养殖场的不多，也少见相关生物除臭剂急性毒性评价试验的报道，同时文献中的微生物除臭剂在实验室条件下，大多需要较长时间堆积发酵才能达到高效除臭效果。

本研究将已筛选出的有益菌制备的复合微生物除臭剂应用于猪养殖场，对其粪污进行短时间处理，以猪粪臭气主要成分NH和HS释放量为研究指标，来评价其对猪排泄物发酵释放的恶臭气味的去除能力，同时对该生物除臭剂进行小鼠和家兔急性毒性检测等毒理学评价，为猪养殖场粪污臭气的高效处理、环境保护及进一步应用推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与粪样 复合微生物菌液包括以下有益菌：罗伦隐球酵母(),10CFU/g;植物乳杆菌(),10CFU/g;枯草芽孢杆菌(),10CFU/g。以上菌株均由西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室提供。

试验用新鲜猪粪采自陕西杨凌某养猪场饲养的健康猪群。

1.1.2 试验动物 昆明种小鼠，购于成都达硕试验动物有限公司；普通级新西兰家兔，购于西安迪乐普生物医学有限公司。

1.1.3 培养基和设备 普通肉汤培养基、乳酸细菌(MRS)培养基、综合马铃薯培养基等，均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

主要设备有电子天平BS2202S、振荡培养箱ZQZY-C8、可见分光光度计L025、DYM空盒气压表L031、KB-6E大气采样器L182等。

1.2 方法

1.2.1 生物除臭剂的制备 将微生物菌株分别于相应的培养基进行震荡培养至对数生长期后期，取培养液按照一定的比例组合制备生物除臭剂，制备的复合微生物菌液中罗伦隐球酵母数≥2.0×10mL，植物乳杆菌数≥2.0×10mL，枯草芽孢杆菌数≥3.0×10mL。

1.2.2 猪排泄物中废气的检测 猪排泄物中废气的检测分为大气环境试验和密闭环境试验，废气检测的指标主要为NH、HS和臭气浓度。其中去除率(%)=(对照组废气浓度-试验组废气浓度)/对照组废气浓度×100%。

1.2.2.1 大气环境试验 处理1：将养猪场中的猪排泄物取500 kg置于2 m的池子中，然后使用200 L清水均匀喷洒和搅拌于猪排泄物中，静置2 h后采用5点采样法从表面0～5 cm处用大气采样器采样。

处理2：将养猪场中的猪排泄物取500 kg置于2 m的池子中(长2 m×宽1 m×高1 m)，然后将复合微生物菌液取1 kg稀释至200 L后均匀喷洒和搅拌于猪排泄物中，静置2 h后采用5点采样法从表面0～5 cm处用大气采样器采样。

1.2.2.2 密闭环境试验 密闭环境试验示意图见图1。将100 g猪排泄物放入2.5 L塑料桶中，密闭静置30 min后开始采集猪排泄废弃物中NH、HS和臭气浓度样品，臭气浓度为瞬时采样，记录除臭前各组分浓度；取2 g复合微生物菌液稀释至1 L，每5 min对塑料桶内进行喷雾，直至复合微生物菌液稀释液全部用完，同时取等量的无菌水作为对照组进行喷雾。喷雾完成后，静置30 min后开始采集NH、HS和臭气浓度样品各1组，臭气浓度为瞬时采样，以上试验均做3个重复。复合微生物菌液喷洒及采集样品过程中尽量保持塑料桶密闭状态，检测项目及时间见表1。

图1 密闭环境试验示意图

表1 猪排泄物中废气的检测

1.2.3 复合微生物菌液小鼠急性毒性的检测 选用昆明种小鼠20只，体重18～22 g，雌雄各半，试验前将其禁食6 h，不禁水。试验设1个剂量组，按原液(罗伦隐球酵母2.0×10mL，植物乳杆菌2.0×10mL，枯草芽孢杆菌3.0×10mL)进行灌胃，灌胃体积为40 mL/kg体重。参照《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》、《药物安全药理学研究技术指导原则》进行小鼠急性毒性试验。按上述剂量一次性经口灌胃给予受试物，观察14 d。记录各组小鼠中毒表现及死亡情况。通过最大耐受量试验结果确定复合微生物菌液对小鼠经口灌胃的LD值。

1.2.4 复合微生物菌液家兔急性毒性的检测 选用检疫合格的成年、健康、皮肤无损伤的家兔4只，试验前一天将家兔背部脊柱两侧毛剪掉，去毛范围左、右侧各3 cm×3 cm，表皮光滑无损。试验时取供试品1 mL均匀涂抹于左侧剪毛区，然后用2层纱布(2.5 cm×2.5 cm)和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。采用封闭试验，敷用时间为24 h，试验结束后用温水清除残留受试物。右侧剪毛区不做任何处理为对照。参照《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》、《药物安全药理学研究技术指导原则》有关规定进行皮肤刺激强度。皮肤刺激评分及强度分级参照表2，皮肤刺激反应评分标准见表3。

表2 皮肤刺激强度评价标准

表3 皮肤刺激反应评分标准

1.2.5 恶臭等级(氨、硫化氢)评价标准 氨评价标准为《工业企业设计卫生标准》(TJ36-1979)，标准限值为0.20 mg/m，硫化氢评价标准为《恶臭污染物排放标准》(GB14554-93)，标准限值为0.60 mg/m。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 猪排泄物臭气的检测结果

复合微生物菌液处理猪排泄物臭气测定结果见表4和表5。从表4可以看出，在大气环境下，加入复合微生物菌液的处理方法相比较于只加入清水的处理方法产生的恶臭气体中NH、HS浓度都明显下降(<0.05)，通过该生物除臭剂处理，NH去除率为76.13%，HS去除率为82.61%，臭气浓度去除率83.25%。在密闭环境下(表5)，相比除臭前，添加复合微生物菌液对恶臭体中的NH、HS具有明显去除效果(<0.05)，NH去除率为80.48%；HS去除率68.42%。臭气浓度去除82.51%。与清水组也有显著降低(<0.05)，表明复位微生物在除臭过程中起主要作用。试验结果表明该生物除臭剂在自然环境与密闭环境下，均有明显的除臭作用，能够将NH和HS等有害气体降低到标准限值以下。

表4 大气环境下猪排泄物臭气的检测结果

表5 密闭环境下猪排泄物臭气的检测结果

2.2 复合微生物菌液小鼠急性毒性的检测

给予受试物后，两组共20只小鼠在给药后14 d观察期内未见其它异常情况，未出现死亡，结果见表6。参照最大耐受量试验规定，得出复合微生物菌液对雄、雌性小鼠的急性经口毒性LD>40 g/kg体重，属于实际无毒级物质。

表6 复合微生物菌液急性经口毒性试验结果统计表

2.3 复合微生物菌液家兔急性毒性的检测

试验期内，家兔试验区皮肤未见红斑和水肿等刺激性反应，每只动物皮肤刺激反应积分均值0(表7)，按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》、《药物安全药理学研究技术指导原则》皮肤刺激性试验有关规定判定为无刺激性。

表7 复合微生物菌家兔急性皮肤刺激性试验结果

3 讨 论

臭气中NH、HS严重危害畜禽正常生长和影响人类健康，这2种气体常作为养殖场环境污染的主要检测指标以及作为衡量除臭剂效果的重要指标。养殖场恶臭来源于动物粪尿、霉变垫料、饲料等，其中主要来源于动物排泄物中未被消化的各种有机物的微生物发酵分解，释放多种挥发性硫化物、NH和挥发性胺类等。畜禽粪便中含有大量土著微生物，是恶臭产生的主要微生物种群。邵栓等报道，以贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和干酪乳杆菌4种微生物菌种复配得到的微生物除臭剂效果最好，通过7 d的堆积发酵，NH和HS的去除率达到63.60%和70.29%。本研究利用酵母菌、乳酸杆菌以及芽孢杆菌3种有益菌制备的复合微生物除臭剂，NH和HS去除率达到76.1%和68.42%以上，取得了高效的除臭效果。该结果可能是因为添加的酿酒酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等复合微生物与猪粪中土著微生物产生拮抗作用，产生了乳酸、乙酸等代谢物，形成酸性环境抑制产生恶臭微生物的生长，减少恶臭气体的产生和释放，或者益生菌自身代谢降解了恶臭物质。复合微生物的除臭机理比较复杂，有待进一步研究探讨。目前大多数微生物除臭剂的研究仅限于实验室阶段，本试验是在生猪养殖场大气环境和密闭环境下进行，为该除臭剂的实际应用提供理论基础。

生物除臭剂的优点还在于安全性高，无二次污染，但是作为微生物制剂，不应该忽视其对环境以及动物和人类带来的潜在危害，必须对其安全性进行评价。本研究使用的复合微生物除臭剂均为自然环境中存在的有益菌，能有效治理养殖场的臭气污染，对昆明种雄、雌性小鼠急性经口毒性LD>40 g/kg体重，且对皮肤无刺激，具有较好的使用安全性。

4 结 论

试验以氨、硫化氢去除率作为衡量除臭剂效果的重要指标，同时经急性毒性评价试验，结果表明本研究使用的复合微生物菌液具有较好的安全性及除臭能力，为猪养殖场粪污臭气的高效处理、环境保护及进一步应用推广提供依据。