郑州地区屠宰场牛羊肉中污染沙门菌的鉴定、毒力基因及耐药性检测

马丽卿，张一鸣

(河南牧业经济学院，河南 郑州 450046)

沙门菌具有广泛的宿主，可以引起多种动物和人的败血症、胃炎、流产等，是临床中重要的人兽共患病原菌之一。该菌是畜产品污染中常见的食源性致病菌，可通过食物链传染给人，对人和动物的危害较大。沙门菌广泛分布于肉、蛋、奶、菜等食品中，肉类食品是沙门菌主要的传播和暴发的载体。相关研究表明，屠宰场中屠宰的肉品、内脏及胴体是污染沙氏菌的重要来源之一，该菌可以通过运输中的动物和未煮熟的动物食品进行传播，该菌危及人类公共安全问题。近几年来关于肉类在屠宰加工过程中沙门菌污染报道逐渐增多，因而屠宰加工过程检测沙门菌具有很重要意义。沙门菌携带毒力岛、鞭毛、菌毛、质粒和脂多糖等多种毒力基因，携带毒力基因在其致病过程中起着重要作用，且与致病性具有一定相关性。抗菌药物是临床中控制沙门菌感染有效的手段，由于抗生素的不合理使用导致多重耐药性沙门菌菌株产生及食品残留等问题，且对人们的健康存在潜在危害。

本试验从郑州地区屠宰场采集肉品样品、胴体拭子、冲洗液等245份，采用《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》方法进行沙门菌鉴定分析其污染情况，检测沙门菌的毒力基因分布情况及耐药情况，为进一步流行病学调查与防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2019年1月-2020年6月，从郑州地区屠宰场采集牛羊肉样品89份、胴体拭子94、冲洗废水62份，共计245 份。

1.1.2 主要试剂 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)、缓冲蛋白胨水(BPW)、药敏纸片，购自广东环凯微生物科技有限公司；沙门菌显色培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；沙门菌生化鉴定试纸条，购自北京天坛药物生物技术开发公司；DL2000 Maker、2×Master Mix，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 分离与培养 采用《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》的方法，将样品处理后，接种于TTB增菌液中，220 r/min 37 ℃培养8 h，划线接种于沙门菌显色培养基，37 ℃培养12 h，挑取单菌落接种于普通营养肉汤中纯化培养，革兰氏染色镜检。

1.2.2 细菌生化鉴定 按说明书对疑似沙门菌菌株进行生化特性鉴定。

1.2.3 细菌PCR鉴定 参考文献，根据GenBank中沙门菌的基因序列，设计鉴定引物invA：5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'，5'-TCTCGCACCGTCAAAGGAACC-3'，引物片段大小为249 bp。采用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用鉴定引物invA进行PCR鉴定，将PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序，测序结果与GenBank中登录的参考株进行同源性比对。

1.2.4 毒力基因PCR检测 参照文献[10]，设计沙门菌14种基因，主要包括毒力质粒基因(、、、、)，毒力岛基因(、、、、)，其他毒力基因(、、、)，引物由上海生工生物技术有限公司合成，以1.2.3制备的菌株基因组DNA为模板，用梯度PCR法进行毒力基因检测。

1.2.5 药敏试验 参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行药敏试验，按照CLSI的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)进行结果判断，分析耐药性。

2 结果与分析

2.1 分离培养结果

疑似沙门菌的菌株在沙门菌显色培养基上长出大小一致、边缘整齐的紫色菌落，革兰染色镜可见无荚膜、两端钝圆的阴性短杆菌；分离菌株用沙门菌生化鉴定试纸条鉴定，经统计94株被鉴定为沙门菌。与《伯杰细菌鉴定手册》报道的沙门菌培养特性、形态学生基本一致。

2.2 细菌PCR鉴定结果

对生化试验初步鉴定为沙门菌的菌株用引物invA对进行PCR鉴定，结果显示94株分离菌株均扩增出大约为251 bp的目的条带，与预期相符(图1)，分菌株的PCR产物测序结果与GenBank中登录的沙门菌的参考株同源性为97.9%～98.9%，说明分离的94株菌株从分子生物学方面鉴定为沙门菌。

图1 分离菌株的PCR鉴定结果

2.3 毒力基因检测结果

用PCR法对分离的94株沙门菌分离株进行14种毒力基因检测，结果显示，分离的94株沙门菌分离株携带12种毒力基因，其中毒力基因、、、、、检出率在45.7%～94.7%之间，毒力基因、、、、、检出率在12.8%～43.6%之间，毒力基因、未检出(表1)。

表1 毒力基因检测结果

2.4 耐药性分析结果

用K-B药敏纸片法对分离的94株沙门菌株进行药敏试验，结果显示，分离的94株沙门菌株对青霉素、阿莫西林、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶、强力霉素、多粘菌素、林可霉素、大观霉素11种抗生素耐药率在50%～97.9%之间，对头孢曲松、头孢噻呋、阿米卡星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星7种抗生素的耐药率在14.9%～30.9%之间(表2)。

表2 药敏试验结果(阳性)

3 讨 论

沙门菌是临床中主要的食源性病原菌，该菌主要存在肉类食品中，尤其在屠宰加工过程中容易感染沙门菌，通过食物传播，可导致人的急性食物中毒、肠炎、腹泻等，严重可以导致死亡，该菌已经危害到公共卫生安全问题。近几年来关于屠宰场及生产链中的沙门菌污染情况的报道越来越多。刘鲜鲜等报道从南宁市不同地区生猪屠宰场采集的300份样品中分离的得到98株沙门菌。孙璐等报道山东鸡肉屠宰环节中采集的样品中分离得到239株沙门菌。刘英玉等报道在新疆地区定点屠宰场、农贸市场采集牛羊胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品 841 份中分离得到47株沙门菌。本试验研究表明，从郑州地区屠宰场采集肉品样品、胴体拭子、冲洗废水等245 份中分离得到94株沙门菌。说明沙门菌在屠宰场中广泛流行，应该引起重视，加强肉类卫生检疫制度。

沙门菌编码基因的中携带多种毒力岛和毒力基因，且致病性的沙门菌携带多种基因及毒力岛呈现正相关，该菌主要定居于宿主的肠道内，侵入宿主肠道的上皮组织细胞内引起肠道病变，与该菌携带的毒力质粒有关，沙门菌Ⅲ型分泌系统在其致病性起着关键作用。因此，沙门菌所携带的毒力基因在其致病过程起着重要作用。本试验研究表明，分离的94株沙门菌分离株携带12种毒力基因，毒力基因、、、、、检出率在45.7%～94.7%之间，其他毒力基因检出率在12.8%～43.6%之间。说明分离的沙门菌携带多种毒力基因，分布比较广泛，孙璐等、崔苗苗等报到的屠宰过程分离的沙门菌携带多种毒力基因一致。其作用机理有待进一步研究。

国内许多研究表明沙门菌产生很强的耐药性，其耐药性产生与其携带的耐药基因有关，还与抗生素使用有关，沙门菌的耐药性可以通过食物在动物与人之间传播，给人们的健康带来潜在的威胁。本试验研究表明，分离的94株沙门菌株对青霉素、阿莫西林、新霉素等11种抗生素耐药率在50%～97.9%之间，对其他抗生素的耐药率在14.9%～30.9%之间。说明从郑州地区屠宰场牛羊肉中污染沙门菌菌株耐药性严重。与张强等、刘英玉等、金宣辰等报道的存在一定差异，可能与地区、屠宰的动物有关，还与屠宰过程中的检疫有关。

4 结 论

本研究分离得到94株沙门菌，携带12种毒力基因；分离的94株沙门菌株对青霉素、阿莫西林、新霉素等11种抗生素耐药率为50%～97.9%，对其他抗生素的耐药率为14.9%～30.9%，说明郑州地区屠宰场牛羊肉中沙门菌污染严重，携带多种毒力基因，且耐药性严重。