甘薯IbSUT1基因的克隆及在不同浓度氮肥和烯效唑处理下的基因表达

秦 桢， 齐素坤， 侯夫云， 李爱贤， 董顺旭， 周媛媛， 王庆美*

(1.山东省农业科学院 作物研究所/农业农村部黄淮海薯类科学观测实验站，山东 济南 250100；2.河北省唐山市开平区市场监督管理局，河北 唐山 063021)

甘薯是重要的贮藏根类粮食作物，其光合作用产物除供给植物体生长发育之外，经过茎转运到地下部，主要以淀粉的形式储存在贮藏根中.

蔗糖是光合作用产物从叶片向外周组织运输的主要形式[1]，蔗糖转运蛋白(sucrose transporters,SUTs)参与了这个过程[2].蔗糖转运蛋白是一种蔗糖/H+共转运体，具有12个跨膜结构域的膜蛋白[3]，利用H+-ATP泵在植物细胞膜内外建立质子浓度梯度，进行蔗糖的跨膜运输[4].根据系统发生学，将已经发现的蔗糖转运蛋白分为5个亚族，分别为SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5[5].它们在蔗糖从源到库的运输调控中发挥核心作用，从而决定植物的生长和发育[6].根据参与不同的蔗糖转运步骤，SUTs可以分为3类：质膜外排载体、质膜内流载体和液泡质体载体[7].蔗糖转运体首先在菠菜中克隆获得，并在酵母中进行了功能验证[8].蔗糖转运蛋白在维持植物体内蔗糖平衡以及调节源-库间蔗糖的分配中起重要作用，参与植物多种生长发育过程.

现有的研究主要是蔗糖转运基因的表达及对逆境环境的适应[9].甘薯是贮藏根类作物，在生产上，合理地调节源-库关系是影响甘薯产量的一个重要因素，而蔗糖转运体在将光合器官合成的蔗糖转运到库器官(甘薯贮藏根)的过程中起重要作用.本试验克隆了甘薯IbSUT1基因，研究其亚细胞定位和基因表达情况，分析生产上常用的施加氮肥和外源施加烯效唑等生产措施对基因表达情况的影响，有利于揭示基因调控机理，指导生产实践.另外，对光合作用产物从叶片经茎到贮藏根转运过程的研究将拓展我们对光合作用产物转运的认识，对增加甘薯贮藏根产量有指导意义.

1 材料与方法

1.1 济薯25组织取样

8月中旬,分别选取济薯25的成熟完整叶(第4～5片)、茎(取样叶片下方)和贮藏根.每个样品来自3个不同的植株，用锡箔纸包裹，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存.

1.2 IbSUT1蛋白质三维结构分析

利用在线软件(https://swissmodel.expasy.org/)分析IbSUT1蛋白质三维结构，选择“BuildModel”模式进行分析.

1.3 氮素处理

选取18株长势一致的济薯25幼苗移栽在18个花盆中，花盆中放置等量沙土，随机平均分为3组进行氮素(尿素)水平处理，氮素有效成分浓度分别为4 mmol/L(N1)、10 mmol/L(N2)、16 mmol/L(N3)，以N1为对照.定期浇等量1/2 Hoagland营养液，保持水分充足.移栽后60 d，每个处理随机选取3个植株，分别取根、茎、叶，处理方法如1.1.对不同处理的甘薯贮藏根，烘干后称干质量.

1.4 烯效唑处理

选取18株长势一致的济薯25幼苗移栽在18个花盆中，花盆中放置等量营养土，定期浇等量的水，保持水分充足.半个月后，随机平均分为3组，叶面分别喷施0 mol/L(CK)、50 mol/L(T1)、75 mol/L(T2)的等量烯效唑溶液，4 d后，每个处理随机选取3个植株，分别取根、茎、叶，处理方法同前.

1.5 数据处理

测定的数据采用Microsoft Excel整理作图，用Excel方差分析选项进行显著性分析.

2 结果与分析

2.1 IbSUT1基因的克隆

试验提取济薯25叶片的mRNA，反转录成cDNA，克隆获得IbSUT1基因，测序分析发现，开放阅读框全长为1 512个核苷酸(图1a)，编码503个氨基酸，其分子量53.21 kD，预测等电点8.45.提取济薯25的基因组DNA，克隆获得了IbSUT1基因的基因组全长序列，测序分析发现，基因全长为1 818个核苷酸(图1b)，包含3个内含子和4个外显子(图1c).

图1 IbSUT1基因cDNA(a)和gDNA(b) PCR产物琼脂糖电泳图和基因结构图(c)

2.2 IbSUT1蛋白亚细胞定位分析

三维结构预测发现，IbSUT1蛋白是一个含有12个跨膜结构域的膜定位蛋白(图2a).试验构建pBI221-IbSUT1-GFP融合表达载体，在拟南芥原生质体中瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位，发现IbSUT1蛋白定位在细胞质膜上(图2b).

图2 IbSUT1蛋白三维结构预测分析(a)和拟南芥原生质体定位(b)

2.3 IbSUT1基因表达谱分析

将1.1中提取的济薯25叶片、茎、根的mRNA，反转录成cDNA，以IbACTIN为内参基因，对其表达谱进行定量分析(图3)，发现IbSUT1基因在叶片、茎、根中都有表达，其中:在叶片中表达量最高，茎中次之，根中最低，且它们之间的差异显著(P<0.05,下同).

图3 济薯25 IbSUT1基因表达谱分析

2.4 氮素处理对IbSUT1基因表达的影响

氮是甘薯生长的必要营养元素，对促进甘薯生长和提高甘薯产量发挥重要作用.为探究IbSUT1基因的功能，我们设计了氮素处理试验.取其成熟叶片、茎、根，提取mRNA，反转录成cDNA，qRT-PCR定量分析发现(图4)：随着氮浓度的增加，与对照相比，IbSUT1在叶片和茎中的表达量显著增加,而在根中的表达量显著降低.烘干后称量贮藏根产量发现，随着施加氮素量的增加，甘薯贮藏根干物质量增加，其中N3处理的产量比对照显著增加.

图4 不同浓度氮素处理对叶、茎、根IbSUT1基因表达和贮藏根产量的影响

2.5 烯效唑处理对IbSUT1基因表达的影响

烯效唑是一种高效的植物生长调节剂.在甘薯的生长过程中，叶面喷施烯效唑能有效抑制甘薯地上部的生长，增加地下部贮藏根产量.选取盆栽长势一致的济薯25，喷施等量不同浓度的烯效唑，4 d后取样,采用qRT-PCR方法测定IbSUT1基因表达量，以未施加烯效唑的处理为对照，结果表明(图5)，烯效唑处理后，IbSUT1基因在叶片、茎中表达量升高，在根中表达量降低，与对照相比，差异显著.

图5 不同浓度烯效唑处理对叶(a)、茎(b)、根(c)IbSUT1基因表达的影响

3 讨论与结论

甘薯贮藏根中的淀粉是叶片光合作用产物以蔗糖的形式在蔗糖转运体的作用下，从叶片经过茎转运到贮藏根中合成的，蔗糖转运体在这个过程中发挥重要作用[10].

SUTs家族在植物中最典型的作用是将蔗糖转运至韧皮部中，实现长距离运输.在烟草中，通过反义RNA试验，证明NtSUT1通过质外体途径将蔗糖装载到韧皮部[11].OsSUT1在水稻多种部位中表达，其在叶片、叶鞘等部位的表达量较高[12-13].玉米ZmSUT1基因在叶片和根中都有表达，且叶片中的表达量明显高于根中[14].我们试验发现,甘薯IbSUT1基因在甘薯叶片、茎、根中都有表达，且在叶片中表达量最高，茎中次之，根中最低.

SUT1基因的表达受到多因素调控.Marco等研究发现,植物菌原体影响NtSUT1的表达[15].花生AhSUT1基因表达受到非生物胁迫,如低温、干旱、盐胁迫的影响[16].芹菜AgSUT1基因在盐胁迫条件下表达量降低[9].水稻OsSUT1基因表达受到磷元素的影响[17].在缺磷的条件下，玉米叶片中ZmSUT1基因的表达上调[14].我们发现,IbSUT1基因表达受到氮素和烯效唑的影响.在适量的氮素条件下，随着氮素含量的增加，叶片和茎中IbSUT1基因表达上调.喷施不同浓度的烯效唑，叶片和茎中IbSUT1基因表达也上调.已有的研究表明，SUT1家族对蔗糖的韧皮部装载和长距离运输起着非常关键的作用，OsSUT1基因很大程度上决定了籽粒的充实情况[18].我们发现,随着IbSUT1基因表达量的上调，贮藏根产量也相应地增加，说明IbSUT1蛋白质参与了甘薯中蔗糖的长距离运输.

综上所述，IbSUT1基因在甘薯叶片、茎和根中都有表达，且在叶片中表达量最高，其表达情况受外源施加氮素和烯效唑的影响;IbSUT1是一个细胞质膜定位的跨膜蛋白质，参与了蔗糖在叶片和茎中的转运过程.