昆布多酚通过调控Wnt/ β-catenin 信号通路抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖侵袭的研究

徐贵颖，张连波，王英丽，尚立华，熊蔚蔚，张 阳*

(1.吉林省肿瘤医院 乳腺外二科，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所；3.吉林省前卫医院)

乳腺癌的发生和发展是一个涉及多基因和多信号通路的过程，Wnt/β-catenin经典通路与乳腺癌的关系是近年来的研究热点，该通路的活化可能导致乳腺癌的发生。昆布属于褐藻门藻类，主要含有矿物质、多糖类、多酚类等多种化合物，药典记载其具有抗炎，抗氧化，抗病毒，抗肿瘤等作用[1]，其中昆布多糖类和多酚类对肝癌、结肠癌、膀胱癌、大肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、三阴乳腺癌的抑制作用皆有研究报道[2-7]。本研究探讨昆布多酚通过调控Wnt/β-catenin信号通路对MCF-7乳腺癌细胞增殖侵袭的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7(吉林省肿瘤防治研究所细胞库提供)。

1.2 主要试剂与仪器干燥昆布(药材购于吉林省长春市福百草大药房，由长春中医药大学药学院中药鉴定教研室张景龙教授鉴定为翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam的干燥叶状体)，IMDM培养基，Gibco产品；MTT(噻唑蓝)，Sigma产品；胎牛血清，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；DMSO(二甲基亚砜)，Sigma产品；低温离心机，SORVALL RTT USA；全自动酶标仪，labsystems Dragon；电泳仪，上海天能；兔抗β-catenin 抗体(一抗)、兔抗β肌动蛋白(β-actin) 抗体，Abcam 公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(二抗)，北京西化仪科技有限公司；TUNEL试剂盒，德国Merk-Calbiochem 公司；Transwell小室，美国Corning公司。

1.3 方法

1.3.1药品制备 取干燥昆布4 kg，用高速粉碎机粉碎后过30目筛后，液料比40∶1，30%乙醇浸泡2 min，微波450 W，100 s，水浴70℃，30 min，重复3次提取，合并提取液，离心5 000 r/min，15 min，上清真空抽滤，抽提液4℃冰箱静置12 h，取上清1∶10醇沉，4℃放置24 h，重复醇沉4次，再次离心浓缩醇沉，即得到昆布多酚提取物，冷冻干燥为粉末，即得到纯化后的昆布多酚类化合物[8-9]。用没食子酸标定昆布多酚。用无血清IMDM培养液配制不同剂量组。昆布多酚高剂量组(100 μg/mL)、中剂量组(50 μg/mL)、低剂量组(25 μg/mL)。

1.3.2细胞培养 将人乳腺癌细胞株MCF-7常规培养于含10%胎牛血清的IMDM培养基中，37℃，5%CO2培养。接种对数期生长细胞至96孔培养板，1×105/孔，分为5组，包括阴性对照组(PBS)，阳性对照组(阿霉素5 μmol/L)，昆布多酚高剂量组(100 μg/mL)，中剂量组(50 μg/mL)，低剂量组(25 μg/mL)，共培养48 h。

1.3.3细胞增殖能力检测 人乳腺癌细胞株MCF-7培养24 h、48 h后，每孔加入浓度为5 g/L的 MTT溶液20 μl，继续培养4 h，弃上清加200 μl DMSO，避光震荡10 min，490 nm酶标仪检测OD值，计算细胞增殖抑制率。

1.3.4Transwell 法检测MCF-7细胞侵袭能力 药物共培养48 h后，取细胞悬液1×105/mL，200 μl接种上室中，底部基质胶上加500 μl 含胎牛血清的IMDM培养基。放入二氧化碳细胞培养箱中培养24 h，弃去上室中的基底胶和MCF-7细胞，放入4%多聚甲醇溶液中固定，附着在上室中的MCF-7细胞进行吉姆萨染色，拍照计数。

1.3.5划痕愈合实验检测MCF-7细胞迁移能力 药物作用48 h后，将细胞接种于6孔培养板中常规培养至细胞铺满板内80%空间，用加样枪头对细胞划线，PBS缓冲液清洗掉落的细胞残渣，继续培养24 h，镜下拍照。细胞迁移率=(1-培养48 h后细胞间距/起始划痕间距)×100%。

1.3.6TUNEL法检测MCF-7细胞凋亡情况 分别用不同浓度昆布多酚处理MCF-7细胞，4%多聚甲醛固定，按试剂盒说明进行DAB显色后，封片，光学显微镜下选取5个视野观察细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3.7Western blot法检测凋亡相关蛋白表达量 不同浓度昆布多酚处理细胞48 h后，裂解细胞提取总蛋白和核蛋白，80 μg/30 μL每孔上样，电泳后湿法转膜，封闭4 h。按试剂盒说明书操作，加一抗(1∶1000)、二抗(1∶1000)，内参为β-actin蛋白，计算相对表达量。

2 结果

2.1经药品制备后得到昆布多酚提取物3 280 mg，昆布多酚得率为4.1 mg/5 g。

2.2 昆布多酚对MCF-7细胞增殖抑制率的影响

与阴性对照组相比，昆布多酚提取物可显著升高对MCF-7的增殖抑制率(P<0.05)，且表现为时间剂量依赖性。结果见表1。

表1 昆布多酚对MCF-7细胞增殖抑制率的影响

2.3 昆布多酚对MCF-7侵袭能力的影响

昆布多酚提取物各组与阴性对照组相比，显著降低Transwell小室上室底部细胞数(P<0.05)，表现为剂量依赖性，结果见图1A和1B。

图1A 昆布多酚对MCF-7侵袭能力的影响(×100)

图1B 昆布多酚对MCF-7侵袭能力的影响

2.4 昆布多酚对MCF-7迁移能力的影响

划痕实验结果显示，昆布多酚各剂量组与阴性对照组相比，显著降低MCF-7细胞迁移能力(P<0.05)，表现为剂量依赖性，结果见图2A和2B。

图2A 昆布多酚对MCF-7迁移能力的影响(×100)

图2B 昆布多酚对MCF-7迁移能力的影响

2.5 昆布多酚对MCF-7细胞凋亡的影响

与阴性对照组比较，昆布多酚显著升高MCF-7的凋亡率(P<0.05)，且呈现剂量依赖性。结果见图3A和3B。

图3A 昆布多酚对MCF-7细胞凋亡的影响 (×100)

图3B 昆布多酚对MCF-7细胞凋亡的影响

2.6 昆布多酚对凋亡相关蛋白β-catenin表达量的影响

昆布多酚不同浓度组，总蛋白β-catenin表达都不受影响(P>0.05)，而细胞核中β-catenin表达随着剂量的增加逐渐减少(P<0.05)。结果见图4。

图4 昆布多酚处理MCF-7细胞后总蛋白、核蛋白β-catenin表达情况

3 讨论

复发转移和肿瘤耐药是威胁乳腺癌患者预后的主要原因，因此探索新药物及机制对于治疗乳腺癌有着重要意义。昆布是药食同源的多年生海藻植物，欧盟在2017年批准腔昆布褐藻多酚(Ecklonia cava phlorotannins)为新资源食品，并允许其作为膳食补充剂[10]，昆布属于褐藻门藻类，其中含有昆布多糖、昆布多酚等多种成分，各组分抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用均有相关报道[2-7,11-12]。

本研究采用昆布多酚提取物处理人乳腺癌细胞株MCF-7，阳性对照药采用疗效确切的阿霉素，发现昆布多酚提取物能够抑制MCF-7细胞增殖，降低肿瘤细胞侵袭和迁移能力，与现有研究结果一致[13-14]。本研究结果表明昆布多酚以浓度依赖的方式抑制 MCF-7人乳腺癌细胞株增殖能力，并促进 MCF-7细胞的凋亡。此外，昆布多酚提取物可降低MCF-7细胞核中β-catenin表达，β-catenin在癌细胞核中的累加表达，与肿瘤的转移相关[15-16]。提示昆布多酚可能通过抑制经典的 Wnt 信号转导对癌细胞发挥抑制作用。Aravindan等[17]研究提出海藻多酚通过干扰正常信号传导，抑制肿瘤细胞增殖。Wnt/β-catenin信号通路参与维持胚胎发育和组织器官稳态[18]。但人体中缺乏Wnt配体时，β-catenin在胞浆中呈游离状态存在，并被多种蛋白组成的降解复合物所招募，通过一系列的激酶串联反应，从而促进降解，而当Wnt配体存在时，与细胞膜上相关蛋白结合，破坏降解复合物，无法有效降解β-catenin，其在胞浆中大量积累，移位至细胞核，启动下游靶基因，促进细胞增殖和转移。研究表明[19-20]，乳腺癌中Wnt信号通路过度活化，通过靶向作用于Wnt信号通路，抑制乳腺癌的发生与进展[21-22]。本研究发现，昆布多酚通过调控Wnt/β-catenin经典通路抑制人乳腺癌细胞株MCF-7增殖、侵袭、迁移，促进细胞凋亡，并呈现剂量依赖性。提示昆布多酚可能对乳腺癌复发转移有一定的抑制作用。