美国白蜡扦插过程中插穗内含物变化分析

常雪薇 ，薛满满，李春明，杨立学*

(1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；2.森林生态系统可持续经营教育部重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨 150040; 3.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150080)

0 引言

美国白蜡(Fraxinusamericana)为木犀科(Oleaceae)白蜡属(Fraxinus)落叶乔木，原产于加拿大南部和美国，最早于20世纪60年代引入我国，在华北地区广泛分布[1-3]。美国白蜡具有耐旱、耐寒、耐涝和耐盐碱等优良特性，是盐碱地造林、公路绿化、城市街道绿化的重要树种[4]。其种子繁殖成活率较高，但是由于美国白蜡的幼龄期长，具有明显的结实间隔性，且种子具有深度休眠的特性，进行播种时要先打破休眠[5]。在无性繁殖中，扦插繁殖具有操作简单、成本较低、材料充足和繁殖速度快等优点，在遗传方面可以保持母树优良的品质，有利于优良个体的扩繁[6]。目前对美国白蜡扦插繁殖报道较少，且主要对扦插技术方面进行了研究，其扦插生根过程中的一系列生理变化及生根类型尚不明确。本试验通过对美国白蜡扦插过程中的内源激素含量和酶活性进行分析，为美国白蜡的生根机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

试验于2020年8月在黑龙江省牡丹江市阳明区茂森苗木种植专业合作社温室中进行(44°6′N，129°63′E)，该地处于中温带大陆性季风气候区，年均降水量约540 mm，年均气温4.3 ℃。试验期间棚内温度保持在20～30 ℃，空气相对湿度维持在90%以上。

1.2 试验材料的选取及处理

从苗圃选择生长健壮的2年生优良母株，选取无病虫害、粗细大致相同的当年生枝条剪成长5～8 cm的插穗，每枝插穗留2～3个芽，1片叶，上端平剪，下端45°左右斜剪，切口距芽约1 cm，上切口用封口胶密封。选用草炭土与蛭石的体积为1∶3作为基质，插穗采用北京博奥拓达科技有限公司生产的外源激素萘乙酸(NAA)(150 mg/L)处理6 h，清水处理为对照，重复3次，每次重复100根。

分别在插后0、6、12、18、24、30 d取样，共取6次，每次重复选取5根插穗用清水冲洗干净，对插穗生根状况拍照记录后取基部2 cm左右韧皮部剪碎称重后装入冻存管，迅速放入液氮罐中保存，待取样完成后干冰冷冻下寄回实验室保存。

1.3 测定指标及方法

内源激素的测定：采用酶联免疫法(ELISA)，称取0.3 g样品加液氮研磨成粉末状，对插穗内生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA3)含量进行测定。

酶活性测定：多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)和过氧化物酶(POD)酶活性选用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒，按照说明书的步骤进行测定。

用Microsoft Excel 2010对数据进行统计分析并做表，用SigmaPlot12.5进行作图。

2 结果与分析

2.1 美国白蜡生根过程中形态学研究

经观测，美国白蜡主要为皮部生根型，少量为混合生根型。扦插前6 d，插穗叶片鲜活无明显变化，插穗基部皮孔变大；第12 天观察到插穗下切口开始膨大，插穗的皮下有白色愈伤组织生成，且部分插穗皮部凸起，形成白色颗粒；第18天观察发现插穗从皮部开始生成不定根，少量在愈伤组织部位处生根；第24天，插穗不定根大量产生并开始伸长，且开始出现侧根。扦插后第30天，插穗不定根持续伸长，且侧根逐渐增多变粗，插穗生根数和形态基本保持稳定。故其生根进程可大致分为3个时期：0～12 d为生根诱导期(愈伤组织形成)，12～24 d为不定根表达期(不定根出现)，24 d后为不定根伸长发育期，如图1所示。

图1 美国白蜡扦插生根过程中段插穗形态

2.2 美国白蜡生根过程中内源激素含量及比值变化

2.2.1 IAA含量变化

美国白蜡生根过程中，NAA处理组与CK对照组内源激素IAA含量变化趋势大致相同，均呈上升—下降趋势。扦插0～6 d，处理组和对照组插穗内源激素IAA含量均上升，并在第6天到达峰值，此时处理组比对照组的同期值高14.08%。扦插12～18 d，处理组IAA含量小幅度地升高。扦插18～30 d，随着不定根的表达和伸长，IAA含量又开始降低。CK对照组插穗6 d后内源激素IAA含量下降，在12～24 d趋于平缓。插穗生根诱导期处理组IAA含量大于对照组，说明外源施加NAA可以增加插穗内源激素IAA含量。如图2所示。

图2 美国白蜡扦插生根过程中IAA含量变化

2.2.2 ABA含量变化

处理组插穗基部ABA含量呈上升—下降—上升—下降趋势，对照组呈上升—下降—上升趋势。扦插0～6 d，处理组和对照组的ABA含量均显著升高。6～12 d，处理组和对照组ABA含量开始下降，此时愈伤组织形成、根原基出现。12～24 d，随着不定根的出现和伸长，处理组ABA含量开始迅速上升，并于第24天达到峰值，为67.71 ng/g，同期值比对照组高出83.70%，此时根源基开始发育、不定根逐渐形成，而对照组缺少激素刺激发育较慢，ABA含量仍呈下降趋势。24 d之后插穗进入到不定根伸长期，处理组ABA含量又开始降低，此时对照组ABA含量开始升高，比处理组落后12 d如图3所示。

图3 美国白蜡扦插生根过程中ABA含量变化

2.2.3 GA3含量变化

处理组GA3含量变化趋势呈上升—下降、对照组呈上升—下降—上升—下降。扦插后0～6 d，2组GA3含量均呈上升趋势，6～12 d开始逐渐降低，12～24 d处理组含量持续降低，对照组含量呈升高趋势，且在第24天达到峰值，为9.72 ng/g，比处理组同期值高19.08%。24 d之后插穗进入不定根伸长发育期，处理组GA3含量开始小幅度升高，对照组GA3含量开始下降，在第30天逐渐和处理组的值趋于一致。如图4所示。

图4 美国白蜡扦插生根过程中GA3含量变化

2.2.4 ZR含量变化

NAA处理组和对照组插穗的ZR含量变化趋势基本一致，均为下降—上升，如图5所示。处理组前6 d ZR含量下降，而后ZR含量一直升高，且前期上升较慢，后期上升较快；对照组扦插后ZR含量降低，且谷值低于处理组，比处理组降低8.85%，6～12 d迅速升高，24 d之后对照组有下降的趋势。0～12 d，插穗的ZR含量先下降后上升，插穗刚脱离母体ZR含量降低，随后进入插穗生根诱导期，且有愈伤组本织的生成，ZR含量升高。12～18 d，插穗开始产生不定根，此时ZR含量一直升高，18～24 d 内源激素ZR含量上升较快。24 d后，处理组ZR含量缓慢上升，对照组下降。

图5 美国白蜡扦插生根过程中ZR含量变化

2.2.5 IAA/ABA值的变化

本研究中发现：处理组IAA/ABA值变化明显，扦插0～12 d处理组的IAA/ABA值下降之后又有所升高，并保持在较高值，此时为生根诱导阶段，说明根原基的诱导需要较高的IAA/ABA值。12～24 d，处理组比值开始降低，此时为不定根表达期，在此阶段ABA含量不断增加，而IAA被消耗，IAA/ABA值下降，于24 d达到谷值0.54，比对照组的同期值低44.33%，这与对照组在12 d之后的变化趋势相反。24 d后，随着插穗不定根的伸长，处理组的IAA/ABA值又开始升高。对照组插穗IAA/ABA值变化平缓，0～12 d比值呈下降趋势，之后12～30 d缓慢升高，且比值一直大于处理组。如图6所示。

图6 美国白蜡扦插生根过程中IAA/ABA值变化

2.2.6 IAA/ZR值的变化

在插穗生根进程中，处理组IAA/ZR值呈上升—下降趋势，对照组IAA/ZR值呈上升—下降—上升的趋势。扦插前 6 d，处理组和对照组的IAA/ZR值均升高，并在第6 天达到峰值，处理组比对照组的同期值高4.51%。6～12 d，2组的IAA/ZR值降低，但仍大于初始值。12～18 d，处理组和对照组IAA/ZR值都处于一个相对稳定的状态，且2组都保持在较高水平，说明高比值的IAA/ZR有助于插穗不定根的表达。18～24 d，2组比值均呈下降趋势，处理组下降速度较快。24 d后处理组IAA/ZR值持续下降，对照组升高。说明高比值的IAA/ZR有助于插穗不定根的表达，如图7所示。

图7 美国白蜡扦插生根过程中IAA/ZR值变化

该试验观察并分析美国白蜡在生根进程中30 d的变化，分别在插后0、6、12、18、24、30 d取样，得出外源激素NAA处理对美国白蜡生根进程中插穗内源激素含量及其比值的特征值影响，见表1。

表1 NAA处理对生根进程中插穗内源激素含量及其比值的特征值影响

2.3 美国白蜡生根过程中相关酶活性的变化

2.3.1 POD活性的变化

处理组和对照组POD活性变化趋势基本一致，均呈现上升—下降—上升的变化趋势。0～12 d，处理组和对照组POD活性升高，在第12天达到最高水平，处理组比对照组峰值低5.57%。之后POD活性开始降低，在扦插24 d之后，又开始升高，24 d之后插穗进入不定根伸长期，POD活性升高，如图8(a)所示。

2.3.2 PPO活性的变化

NAA处理组和对照组PPO活性变化趋势大致相同，都呈上升—下降趋势，但出现峰值的时间不同。扦插前期，对照组和处理组酶活性均增加。处理组在12 d达到峰值比对照组同期值高96.97%，既在愈伤组织形成期和不定根发生过渡期PPO活性达到最高。扦插后12～24 d，处理组PPO活性逐渐降低，并在第24天达到最小值。24 d后插穗体内PPO活性逐渐回升。如图8(b)所示。

图8 美国白蜡插穗生根过程中氧化酶活性变化

2.3.3 IAAO活性的变化

NAA处理组的IAAO活性变化趋势呈上升—下降—上升，对照组呈升高—下降—升高—下降。扦插初期，处理组和对照组IAAO活性均升高，NAA处理组峰值比对照组高16.16%；扦插6～18 d，处理组IAAO活性降低，且在第18天降低至最小值；扦插18～30 d，NAA处理组的IAAO活性开始升高，IAAO活性的升高导致同期IAA含量的下降。对照组插穗在扦插12 d之后IAAO活性就开始升高，比处理组提前6 d；对照组在24 d之后IAAO活性开始降低，与处理组趋势相反，如图8(c)所示。

通过对美国白蜡生根过程0～30 d 的观察，得到外源激素NAA处理对生根进程中插穗氧化酶活性的特征值的影响，见表2。

表2 NAA处理对生根进程中插穗氧化酶活性的特征值影响

2.4 各生理指标间相关性分析

由表3相关性分析结果表明，在生根过程中IAA含量与ABA、GA3含量和PPO酶活性之间呈极显著正相关关系(P<0.01)；ABA与GA3含量及PPO活性之间呈显著正相关关系(P<0.05)；GA3含量与PPO活性之间呈极显著正相关关系(P<0.01)，与IAAO活性呈显著正相关关系(P<0.05)；POD与PPO活性之间呈极显著正相关关系(P<0.01)。

表3 插穗不同生长阶段生理指标相关性分析

3 结论与讨论

3.1 结论

美国白蜡插穗生根过程根据其外部形态变化可分为3个阶段：0～12 d为生根诱导阶段；12～24 d为不定根表达阶段；24 d后为不定根伸长阶段。较高含量的IAA和ZR有利于插穗根原基的产生。较低含量的IAA、ABA和较高含量的GA3、ZR有利于插穗不定根的伸长。较高的IAA/ABA和IAA/ZR值有利于根原基的发生，不定根的发生和伸长需要较低的IAA/ZR值。外源激素的使用在一定程度上影响着酶活性的变化。高活性的POD和PPO有助于根源基的形成和不定根的分化，低活性的IAAO有助于根原基的形成和不定根的表达，高活性的IAAO有利于不定根的伸长。

3.2 讨论

生长素的动态变化是研究植物扦插内源激素的重点，普遍认为IAA能够有效促进不定根的发生和伸长。在扦插过程中，插穗不定根的生成受到多种因素影响，其中生长素对插穗生根具有明显的促进作用[7-8]。本研究发现，IAA对插穗生根具有直接影响，生根诱导和不定根表达都需要较高水平的IAA，这与史锋厚等[9]对南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)的研究结果一致；在不定根表达期，处理组的IAAO活性降低到谷值，使得被IAAO氧化分解的IAA减少，因此处理组IAA含量上升并达到峰值，这与胡国宇等[10]对费约果(Feijoasellowiana)扦插的研究结果一致。

ABA通常被认为是生根抑制剂，插穗内ABA含量越高，插穗生根越困难[11]，其主要生理功能为抑制细胞分裂，促进叶片脱落。一般认为ABA对逆境激素的调节作用明显，所以研究插穗体内的ABA含量的变化有着重要的意义。ABA在逆境条件下可以引起植物气孔关闭，提高植物抗逆性，本研究中扦插初期插穗ABA含量升高，可增强离体插穗对逆境的适应性，降低逆境对切口损伤的影响，并对根原基的产生做准备，这与朱晗等[12]对沙生柽柳(Tamarixtaklamakanensis)的研究结果一致。之后在不定根发生阶段ABA含量持续增加，在不定根伸长阶段ABA含量又开始降低，这与杨宏伟等[13]对黑枸杞(Lyciumruthenicum)的研究结果一致。多数情况下植物生长发育过程受多种激素的调节，植物不定根的形成也是多种植物激素共同影响的结果，因此在激素含量变化中研究两两比值可以更全面地评述多种激素对扦插不定根发育的影响[14]。ABA与IAA含量呈极显著正相关关系，ABA通过与IAA 的平衡来调控插穗的生根，较高的IAA/ABA值可促进插穗生根[17]。外源激素的使用虽然没有使插穗体内ABA含量降低，但是却调节了IAA/ABA的比值，对插穗体内内源激素的动态平衡起到了调控作用，进而促进插穗生根；在不定根伸长期，较低的IAA/ABA值有利于美国白蜡不定根的伸长发育。

GA3是细胞分裂的促进物质，能促进植株茎的伸长，普遍认为高含量的GA3阻碍根原基形成[15-16]。在本次研究中，GA3含量在扦插初期有所升高，处理组含量在根原基诱导和不定根伸长发育阶段持续降低，低含量的GA3有助于根源基的产生与不定根的伸长，这与韩继红等[17]的研究结果一致。在不定根表达期，处理组的GA3含量降低，对照组的GA3含量升高，这可能是由于外源激素的使用抑制了GA3的产生，导致处理组和对照组变化趋势相反。IAA与ABA、GA3含量之间呈极显著正相关关系，三者之间相互影响共同调控美国白蜡的生根过程。

ZR是一种主要的天然游离型细胞分裂素，有研究认为ZR抑制不定根的形成[18]。ZR含量先降低后持续升高，外源激素的使用降低了不定根形成期插穗的ZR含量，说明根源基诱导不定根形成要求低含量的ZR。IAA/ZR值在愈伤组织形成初期升高，NAA处理提高了插穗的IAA/ZR值，且较高的IAA/ZR值有助于根原基的生成，这与胡国宇等[10]对费约果的研究结果一致。不定根表达前期，处理组和对照组IAA/ZR值都处于一个相对稳定的状态，且2组都保持在较高水平，说明当IAA/ZR值较高且相对稳定时有利于根源基的发育。不定根表达后期由于不定根大量生出且开始伸长，消耗大量 IAA，同时插穗自身可能合成内源ZR，ZR相对含量升高，使得IAA/ZR值逐渐下降，较低的IAA/ZR值有利于不定根的伸长。

在插穗生长和生根过程中，酶具有重要作用。目前对酶活性的研究主要集中在IAAO、POD、PPO与扦插生根的关系[19-20]。POD是一种活性较高的酶[21]，其活性在许多植物的扦插中被用于界定生根阶段(根源基诱导期、不定根表达期)。本研究扦插前期POD活性增高，此时为愈伤组织形成和不定根出现的过渡时期，说明POD酶活性的增高可促进美国白蜡愈伤组织的形成和不定根的分化。在伸长期之前，2组的POD活性呈单峰变化趋势，在不定根伸长期POD活性有所回升，在整个生根过程中处理组与对照组之间的POD活性差异不显著，说明NAA的使用对美国白蜡插穗韧皮部的POD活性影响不大。

通过油橄榄(Oleaeuropaea)[22]扦插发现，生根率较低的插穗PPO活性较低，而生根率较高插穗PPO活性较高，鞑靼忍冬(Loniceratatarica)[23]的扦插中PPO活性峰值大多出现在不定根表达、生根和伸长阶段，高PPO活性有利于插穗生根。本研究结果表明PPO活性在根源基发育期达最高水平，说明较高的PPO活性有利于根原基的诱导与根系的发育。PPO活性与IAA含量呈极显著正相关关系，可能是由于PPO可以催化酚类物质与IAA合成“IAA-酚酸复合物”，通过调节IAA的代谢，促进愈伤组织和不定根的产生[24]。在不定根表达期酚类物质分解，插穗不再需要大量的PPO，因此PPO活性降低。随着处理组根系进入伸长期，插穗发育成完整的个体，PPO活性增加。NAA的使用提高了处理组PPO活性，这与黄梅等[25]的研究结果一致。PPO与POD活性呈极显著正相关关系，生根过程中两者的变化趋势相似，而在对美国薄荷(Monardadidyma)[26]的研究中，PPO与POD活性呈负相关关系，这2种酶之间的相互作用还需进一步研究。

IAAO是植物体内广泛存在的一种酶，可以通过对插穗内的IAA含量调控来实现对插穗生长的影响。本研究中，在不定根表达期插穗体内IAAO活性降至最低，从而使IAA含量升高促进生根，这与郑巧巧等[27]的试验结果一致。美国白蜡插穗生根与IAAO、POD、PPO活性紧密联系，但在不同的生长阶段IAAO、POD、PPO活性之间是否存在联系尚不明确。

本研究记录了美国白蜡插穗的生根过程和生根类型，划分了生根阶段，对生根过程中4种内源激素含量与3种氧化酶活性进行了研究，对美国白蜡的生根机理进行了初步探究。但林木扦插生根是一个复杂的过程，美国白蜡生根过程中的矿质养分(锌、锰和铁等)含量以及酚类化合物含量对插穗生根的影响有待进一步研究。