陕西6个主栽核桃品种花粉特性研究

张焕玲，童开林，梁烜毓

(1.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100；2.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)

0 引言

品种混杂、良种化程度低是当前核桃栽培中普遍存在的问题[3-5]，极大地限制了核桃产业的健康发展。杂交育种是核桃良种选育的主要途径，核桃属雌雄同株异花树种，雌雄花期不严格一致，花粉活力及贮藏特性是核桃杂交育种能否取得成效的关键。花朵是植物的繁殖器官，具有稳定的遗传特性，花粉形态是品种鉴定的重要指标，同时也是影响杂交育种中授粉方式与方法的重要因素[6]。因此，开展核桃花粉活力、贮藏特性及形态特征研究，可为核桃杂交育种及品种鉴定提供依据，促进核桃产业健康发展。

关于植物花粉活力测定的文献报道已经很多，但胡桃属树种花粉研究多集中在山核桃方面，核桃花粉活力的研究相对较少。胡青等[7]用TTC染色法测定了‘漾濞大泡’与‘云新高原’核桃花粉活力；肖真真等[8]比较了3种染色剂对‘新新2号’核桃花粉活力的测定效果，各种染色剂在不同品种中的表现不尽相同。核桃花粉贮藏条件的研究报道更少，刘杜玲等[9]对5个核桃品种贮藏温度进行了研究，发现3 ℃和-20 ℃条件有利于核桃花粉活力保持，但不同核桃品种最适贮藏温度不同；杜晋城等[10]则发现5 ℃比-20 ℃和-70 ℃条件更利于核桃花粉贮藏，且-70℃条件下核桃花粉活力只能保持不到1 d。核桃花粉形态研究早期多借助光学显微镜，后期采用扫描电镜技术，主要涉及新疆主栽核桃品种[11]、胡桃科不同属树种[12]、薄壳山核桃品种[13]，均发现不同树种/品种在花粉粒大小、表明饰纹和萌发孔等方面存在不同程度差异。未见关于陕西主栽核桃品种花粉形态的研究报道。

本研究以陕西主栽的6个核桃品种花粉为研究对象，在研究筛选花粉活力测定方法的基础上，开展了6个核桃品种花粉生活力、贮藏特性及扫描电镜形态研究，以期为核桃杂交育种、栽培和品种鉴定等提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为6个陕西主栽核桃品种的花粉，即‘清香’‘香玲’‘西扶1’‘西洛3’‘中林5’‘陕核’，采自西北农林科技大学周至县渭河试验站核桃种质资源收集圃。

1.2 方法

1.2.1 花粉收集

采集各品种盛花期散粉中期的雄花序，带回实验室平铺于硫酸纸上，室温(20 ℃)下放置至花药全部开裂散粉，花粉经自然干燥至含水率约为20%时，收集于玻璃指形管内(瓶口用脱脂棉塞)，将指形管置于室温避光处室温贮藏，或置于干燥器内冰箱低温贮藏。

看似凌乱的笔墨，点点是辛酸泪，满纸墨葡萄，一腔哀怨无人倾听。透过这一颗颗晶莹透彻的葡萄似乎可以看到五百多年前徐渭满腹忧愁，空有一身才华无人问津而独自哀怨。怀才不遇的悲愤、明珠暗投的无奈像一把利刃残酷地将徐渭扼杀在渡往梦想彼岸的扁舟上，满腔义愤化成颗颗明珠闲掷野藤之中。就这样，“几间东倒西歪屋，一个南腔北调人”悄悄地走进了尘封的烟尘……

1.2.2 花粉活力测定方法比较

以刚收集的6种花粉为试材，比较不同染色剂对核桃花粉活力的测定效果，为花粉贮藏实验中活力测定选择简捷方便的测定方法，以培养基法做对照。

染色液选用3种：1%TTC(氯化三苯基四氮唑)、0.5%MTT(噻唑蓝)和I2-IK(碘-碘化钾)，参考肖真真等[8]的研究方法，培养基法参考朱雪晨等[14]的研究方法。

花粉活力计算：①染色法花粉活力=(染色花粉粒数/总花粉粒数)×100%。②培养基法花粉活力=(萌发花粉粒数/总花粉粒数)×100%，花粉管长度超过花粉粒直径的一半视为萌发。每种方法重复3次，显微镜(奥林巴斯 CX23)10 倍镜下统计3个视野。

1.2.3 花粉贮藏特性研究

将收集的6种干燥花粉分别置于室温(20 ℃)、4 ℃和-20 ℃冰箱内保存。从保存之日起，每隔1 d测定不同贮藏温度下的花粉活力，直至活力丧失。花粉活力测定使用1.2.2中筛选的染色法。

1.2.4 花粉电镜扫描

用扫描电子显微镜(SEM,日立S-4800)观察花粉粒形态特征。将收集的新鲜花粉在无水乙醇中浸泡脱水1～2 h，待其自然干燥24 h后，将花粉均匀撒于粘有双面导电胶的样品托上，真空喷金镀膜，置于电镜下扫描拍照。每个品种随机选取10枚花粉在1 800～10 000 倍镜下拍照。用Photoshop CS 6.0测量花粉粒的极轴、赤道轴，萌发孔的长轴和短轴及其比值，并根据王开发等[15]的分类标准划分花粉形状类型。将10个花粉粒单侧萌发孔数量平均数乘以2，即为该品种花粉粒的萌发孔数量。

1.2.5 数据统计分析

所有数据用SPSS 20.0软件中的one-way ANOVA进行LSD检验，其中花粉活力数据经反正弦转换、萌发孔数量经倒数转换后进行分析。

2 结果与分析

2.1 核桃花粉活力测定方法比较

不同方法测定6种核桃花粉活力结果见表1。结果表明，6种核桃花粉经MTT染色后均有染成深红色的花粉和未染色的花粉，且能明显识别，如图1(a)所示，这与MTT在玉兰[16]、‘新新2号’核桃[8]中的报道结果类似。相反地，TTC染色法只能识别‘香玲’有活力和失活的花粉，I2-IK染色法只能识别‘西扶1’和‘陕核’有活力和失活的花粉，其他品种的花粉均被TTC染成了红色，如图1(b)所示，被I2-IK染成了深蓝色，如图1(c)所示，无法识别有活力和失活的花粉。这与段青等[17]在大丽花、郝家臣[18]、王非等[19]在核桃楸、肖真真等[8]在‘新新2号’核桃中的研究结果类似，但与胡青等[7]在‘漾濞大泡’与‘云新高原’核桃中的研究结果不一致。

(a)MTT (b)TTC (c)I2-IK

表1 核桃花粉活力不同测定方法比较

6个核桃品种MTT染色所测定的花粉活力均比在同一种培养基中测定的活力高，高出范围在1.33%～11.86%，平均高出约4.6个百分点。花粉活力染色法测定结果高于培养基法测定结果的现象在通关藤[20]和山茶属[21]研究中也有发现。虽然MTT染色法与培养基法在同一核桃品种中测定结果不一致，但2种测定结果除在‘香玲’和‘西扶1’中显著差异外(P<0.05)，在其他4个品种内均无显著性差异(P>0.05)，而且2种方法测定的6个核桃品种花粉活力大小变化趋势是一致的，花粉活力由大到小均依次为：‘中林5’‘香玲’‘西洛3’‘陕核’‘清香’‘西扶1’。

以上结果说明MTT在核桃花粉活力测定中具有较强的广谱性，测定结果可以用来衡量品种间花粉活力的大小。

2.2 6个核桃品种的花粉贮藏特性

研究了6种核桃花粉在3个温度条件贮藏不同时间的活力变化情况，如图2所示，由图2可知，6个核桃品种花粉初始活力差别大，‘中林5’和‘香玲’活力相当，且显著高于其他品种(P<0.05)，分别为37.31%和35.56%；‘西洛3’活力次之，为24.79%；‘陕核’‘清香’‘西扶1’活力较低，无明显差异(P>0.05)，分别为19.26%、17.71%和16.99%。

每个温度下的柱状图从左到右依次代表贮藏0,1,2,…,n d的花粉活力。

3种温度下6种核桃花粉活力均呈现随贮藏时间延长而快速降低的趋势。室温(20 ℃)下贮藏的核桃花粉寿命很短，只存活4～5 d，‘香玲’‘西洛3’‘陕核’‘中林5’在贮藏4 d后花粉活力为0，‘清香’‘西扶1’在贮藏5 d后花粉活力为0。

4 ℃条件下，除西扶1外，其他5种花粉寿命都有所延长，‘香玲’‘清香’‘西洛3’‘陕核’‘中林5’分别延长至9、8、10、11、13 d，比室温(20 ℃)下寿命延长了5～9 d。‘西扶1’花粉在4 ℃和温室(20 ℃)下的寿命一样，但花粉活力在前4 d的降低速率要比室温(20 ℃)下慢很多。4 ℃下清香花粉寿命得以延长，但在前4 d的活力下降要比室温(20 ℃)快，其他品种的花粉在整个贮藏期活力降低速率明显低于室温(20 ℃)。

-20 ℃条件不利核桃花粉贮藏，除‘清香’和‘西洛3’与室温(20 ℃)下的寿命一样，其他4种花粉的寿命都比室温(20 ℃)下短，只有2 d时间。贮藏期间6个核桃品种花粉在4 ℃下的活力明显高于-20 ℃条件。

2.3 6个核桃花粉形态特征

扫描电镜观察核桃花粉的外部形态特征如图3所示，发现供试的6个核桃品种花粉粒均为单粒，外形相似，极轴与赤道轴比例在1.03～1.1，见表2，形状均为近球形。花粉粒表面均密集均匀分布有颗粒状突起，‘清香’‘香玲’‘西扶1’‘中林5’和‘陕核’5个品种在颗粒状突起与突起之间隆起形成脊，脊与脊相互连接形成网状纹饰，‘西洛3’颗粒状突起无脊连接，如图4所示。

图3 6个核桃品种花粉粒电镜扫描形态

箭头所指为连接2个突起之间隆起的脊。

6个核桃品种花粉粒表明均具13～20个数目不等的圆形萌发孔，萌发孔内部凹陷，外周突起(‘清香’‘西洛3’‘中林5’和‘陕核’突起明显)，其上未发现膜结构。萌发孔数量品种间差异显著(P<0.05)，最多的是‘中林5’和‘陕核’，平均为18个和18.3个，‘清香’和‘西扶1’萌发孔数量居中，平均为15.7个和14.7个，‘香玲’和‘西洛3’萌发孔数量最少，平均为13.7个和13个。不同品种萌发孔长轴与短轴无显著差异(P>0.05)，长轴在3.26～3.75 μm，短轴在2.75～3.35 μm，长短轴比例在1.06～1.21。萌发孔长轴最长的品种是‘清香’，为3.75 μm，最短的品种是‘西扶1’；短轴最长的品种是‘西洛3’，最短的是‘陕核’，见表2。

表2 6个核桃品种花粉粒萌发孔形态特征比较

6个核桃品种花粉粒大小存在显著差异(P<0.05)，见表3，极轴长度在39.19～44.35 μm，赤道轴长度在35.58～42.86 μm。‘清香’‘陕核’花粉粒极轴较长，分别为44.01 μm和44.35 μm，显著长于其他4个品种。‘西扶1’花粉粒极轴居中，为41.43 μm，‘香玲’‘中林5’‘西洛3’极轴长较小，分别为39.78、39.19、39.54 μm。‘清香’‘陕核’和‘西扶1’花粉的赤道轴显著长于其他3个品种(P<0.05)，分别为42.86、41.63、40.53 μm，‘西洛3’赤道轴最短，为35.58 μm。综合极轴和赤道轴长度数据可知，‘清香’‘陕核’，花粉粒相对较大，‘西扶1’居中，‘香玲’‘西洛3’和‘中林5’花粉粒相对较小，但都属于中等大小的花粉粒[15]。

表3 6个核桃品种花粉粒大小比较

3 讨论与结论

3.1 讨论

花粉活力测定主要有培养基法、染色法和电导率法3种方法。电导率法因受环境影响大，可靠性难以保证，近年来很少采用。培养基法是用花粉萌发力来间接测定花粉活力的一种方法，结果较可靠，但操作麻烦，不同树种花粉萌发需要不同培养基成分[6]。染色法因简单快速，近年来被大多研究者采用。已报道使用较多的染色剂有TTC、I2-IK、MTT和醋酸洋红，但不同染色剂对不同树种花粉染色效果差异较大[7-8,10-11,14-19]。如用TTC可有效测定‘漾濞大泡’与‘云新高原’核桃花粉活力[7]，但在核桃楸[18-19]、大丽花[16]和‘新新2号’核桃[8]花粉活力测定中效果较差。I2-IK在葛根[22]、通关藤[20]花粉活力测定中染色效果较好，但在大丽花[16]、核桃楸[18-19]、‘新新2号’核桃[8]中效果不佳。本研究发现TTC和I2-IK均不适合6个核桃品种花粉活力测定，但MTT能很好区别6个核桃品种有活力与失活的花粉，MTT也适合于‘新新2号’核桃[8]和玉兰[16]花粉活力测定。这说明染色剂在花粉活力测定中具有极强的选择性，在利用染色法测定核桃花粉活力时，TTC和I2-IK对品种的选择性更强，不具有广谱性，而MTT对品种的选择性较小，可以用来测定更多核桃品种的花粉活力。

花粉寿命是影响杂交育种成效的关键因素之一[6]，研究表明，在20%含水率、黑暗条件下，6个核桃品种花粉寿命均较短，温室(20 ℃)条件下只有4～5 d，且活力下降明显，因此在核桃杂交育种中尽量使用新鲜花粉进行控制授粉，不要使用散粉2 d后的花粉。6个品种的花粉初始活力都较低，最高只有37.31%，因此在杂交育种中进行控制授粉时要采用增加花粉量和重复授粉次数措施，以确保提高受精率。本研究发现4 ℃有利于核桃花粉贮藏，花粉活力保持期限较室温条件(20 ℃)长，但-20 ℃条件下花粉很快会丧失活力。冷冻温度不适合核桃花粉贮藏的结论也有报道[9-10]，这可能与核桃花粉缺乏冰冻保护物质有关，可在保存时使用甘油等冰冻保护剂措施，但保护剂是否会影响花粉活力及受精能力是值得考虑的。

花粉粒形态特征是物种鉴定的重要指标之一，刘剑锋等[23]通过扫描电镜观察发现，5种秋子梨品种的花粉粒形态大小存在的差异，可以作为品种鉴别分类的依据。曹清河等[24]通过观察甘薯近缘野生种的花粉粒大小、两轴长短、萌发器官特点和表面纹饰类型把种类予以区分。毛霞等[12]对胡桃科6个属的花粉进行了研究，发现花粉的外壁纹饰是最有价值的种属分类依据。这些研究多是同属不同种的植物，花粉粒形态差异较大。本研究涉及的6个品种是同一个种，花粉形态和表面饰纹区别不明显，据此鉴定品种难度较大，但在花粉粒相对大小及萌发孔数量方面品种间差异显著，可作为品种鉴定的依据。

3.2 结论

本研究对陕西省主栽的6个核桃品种花粉特性进行了研究，发现TTC、I2-IK不能区分有活力与失活花粉，因而不适用于核桃花粉活力测定；MTT对品种选择性小，适合作为核桃花粉活力的染色剂使用，其和培养基法测定的品种间花粉活力趋势一致。在20%含水率、黑暗条件下，6个核桃品种的花粉寿命都比较短，温室(20 ℃)条件下寿命只有4～5 d，适温条件下贮藏寿命也不会超过14 d。6个核桃品种花粉初始活力差异显著，‘中林5’和‘香玲’的花粉活力显著高于其他4个品种。4 ℃有利于核桃花粉贮藏，可有效延长6种花粉寿命5～9 d；-20 ℃并不利于核桃花粉贮藏，4个品种的花粉寿命在-20 ℃条件下只存活2 d。

6个核桃品种花粉均为近球形单粒花粉，大小差异显著，极轴长度在39.19～44.35 μm，赤道轴长度在35.58～42.86 μm，属中等大小的花粉粒，‘清香’和‘陕核’花粉粒相对较大，‘西扶1’居中，其他3个品种最小。6种核桃花粉粒表面均有颗粒状突起，大多突起由隆起的脊相连，形成网状饰纹。花粉粒表面的圆形萌发孔数目在品种间差异显著，有13～20个不等，短轴在2.75～3.35 μm，长轴在3.26～3.75 μm。