不同贮藏年份霍山石斛枫斗质量分析
2022-09-25戴亚峰胡莉王诗文张林纵瑞叶黄月纯魏刚
戴亚峰，胡莉，王诗文，张林，纵瑞叶，黄月纯，魏刚
（1.九仙尊霍山石斛股份有限公司，安徽六安 237000；2.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006；3.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；4.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）
霍山石斛Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng（D.huoshanense）为兰科石斛属多年生草本植物，又称“米斛”，仅分布于安徽省霍山县及其邻近地区，乃石斛中的极品[1]，具有清胃除虚热、益胃生津、厚肠胃、轻身延年、补虚羸等多种功效[2]。现代药理学研究表明，霍山石斛具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗肝损伤、增强免疫力和抗白内障等药理作用[3-6]，主要药理成分包括多糖类、黄酮类、氨基酸、生物碱类及微量元素等[7]，其中多糖类和黄酮类成分是其含量最高的主要活性成分。
霍山石斛枫斗，也称为“霍斗”“金斗”，是以霍山石斛茎为原料，经多道工序制成的弹簧状干品，形如“龙头凤尾”，其工艺被列为“省级非物质文化遗产”[8]。新鲜的石斛不能长久保存，而通过加工成枫斗后石斛就不易霉烂、虫蛀和变质。同时，由于石斛类植物的茎中黏液成分丰富，加工成枫斗后，有效成分被固化而更加稳定，不易分解。霍斗价格昂贵，对不同贮藏年份的霍斗进行主要成分分析可保障药材的质量，为其贮藏、开发、评价等提供参考。本研究对贮藏0、2、4、6年的霍斗进行了高效液相色谱（HPLC）特征图谱分析，同时测定夏佛塔苷、异夏佛塔苷2种主要黄酮类成分含量，并进行了多糖HPLC柱前衍生含量测定，分析贮藏时间对霍斗品质的影响，研究结果对于指导企业进行标准化生产加工以及科学贮存霍斗具有重要指导意义，现将研究结果报道如下。
1 材料
1.1 仪器与试剂HP1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司，DAD检测器）；MS-204S电子天平（d=0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；MS-105 Du电子天平（d=0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merk公司）；其余试剂均为分析纯；水为屈臣氏蒸馏水。
1.2 试药夏佛塔苷对照品（批号：111912-201302；纯度≥95%），中国药品生物制品检定院；异夏佛塔苷（批号：52012-29-0；纯度≥95%），法国Extrasynthese公司；对照品D-葡萄糖（批号：110833-201506；纯度≥99.9%）、D-甘露糖（批号：140651-201403；纯度≥99.6%），中国食品药品检定研究院；D-盐酸氨基葡萄糖（批号：RFS-Y16101912009；纯度＞98%）购自成都瑞芬斯公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批号：A1216009），阿拉丁试剂上海有限公司生产；12批（S1～S12）不同贮藏年份（0、2、4、6年各3批）霍山石斛枫斗均由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定为霍山石斛的枫斗加工品，见图1。将霍斗剪碎，打粉，过4号筛（65目）。
图1 不同贮藏年份霍山石斛枫斗外观性状Figure 1 External properties of D.huoshanense Fengdou after different years of storage
2 方法与结果
2.1 HPLC特征图谱分析
2.1.1 色谱条件Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流动相为甲醇+乙腈（A，v/v=1∶1）-0.01 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，14%～18%A；20～35 min，18%～22%A；35～45 min，22%～26%A；45～55 min，26%～30% A）。流速0.8 mL/min，柱温40℃，检测波长340 nm，进样量10μL。
2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粉末（过4号筛）1 g，精密称定，加入80%甲醇50 mL，超声提取1 h；取出，放冷至室温；滤过，用适量80%甲醇洗涤滤渣；合并滤液，挥干溶剂，残渣加60%甲醇溶解至5 mL容量瓶中；加60%甲醇定容，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.1.3 方法学考察
2.1.3.1 精密度考察 精密吸取同一供试品溶液（S1）10μL，连续进样6次。结果显示，12个共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积的相对标准偏差（RSD）为2.1%，表明仪器的精密度良好。
2.1.3.2 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液（S1）10μL，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样。结果显示，12个共有特征峰的保留时间及相对峰面积的RSD均为1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.3.3 重复性考察 取同一样品（S1）6份，依法制备，进样。结果显示，12个共有特征峰的保留时间及相对峰面积的RSD均为2.7%，表明该方法重复性良好。
2.1.4 样品的测定
2.1.4.1 共有峰的标定HPLC特征图谱结果表明，12批霍山石斛枫斗样品共标定12个共有峰，其中包括药典规定的5个特征峰（峰3：夏佛塔苷；峰4：异夏佛塔苷；峰7：芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-（1→2）-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖；峰8：芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-α-L-鼠李糖-（1→2）-β-D-葡萄糖；峰9：芹菜素-6，8-二-C-α-L-阿拉伯糖[9]）。结果见图2。其相对保留时间与相对峰面积以峰3（夏佛塔苷）为参照峰计算。结果见表1。
表1 12批霍山石斛枫斗高效液相色谱（HPLC）特征图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积Table 1 Relative retention time and relative peak areas of common peaks in characteristic chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou by HPLC
图2 12批霍山石斛枫斗高效液相色谱（HPLC）特征图谱重叠图Figure 2 Overlapping image of HPLC specific chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou
2.1.4.2 共有峰相似度分析 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版）软件进行相似度分析，以均值数法生成对照图谱，12批样品与对照图谱的相似度为0.971～0.997，相似度良好，结果见表2。
表2 12批霍山石斛枫斗高效液相色谱（HPLC）特征图谱相似度结果Table 2 Similarity results of HPLC specific chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou
2.2 夏佛塔苷、异夏佛塔苷含量测定
2.2.1 色谱条件 同“2.1.1”项。
2.2.2 供试品溶液的制备 同“2.1.2”项。
2.2.3 方法学考察
2.2.3.1 精密度、稳定性、重复性考察 同“2.1.3.1～2.1.3.3”项。
2.2.3.2 线性范围考察 取夏佛塔苷和异夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇分别制成每1 mL含夏佛塔苷28.12μg、异夏佛塔苷25.94μg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液各1、2、5、10、15、20、25μL，按拟定色谱条件测定峰面积。以进样量X（μg）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。夏佛塔苷的回归方程为Y=1 858.1X-1.855 0，线性范围为0.028 14～0.703 5μg，r=0.999 9；异夏佛塔苷的回归方程为Y=1 894.3X-3.019 8，线性范围为0.025 94～0.648 5μg，r=0.999 9。
2.2.3.3 加样回收率考察 称取6份已知含量的霍山石斛枫斗样品（S1），每份约0.5 g，精密称定，分别加入一定量的夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品，依法制备。进样测定，记录峰面积，计算得二者平均回收率分别为98.36%、101.17%，RSD均小于3%。
2.2.4 样品的测定
2.2.4.1 对照品与样品图谱分析 分别取夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品溶液，混合对照品溶液以及供试品溶液（S1），按拟定色谱条件进样分析，得到色谱图，见图3。
图3 夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品及霍山石斛枫斗样品（S1）高效液相色谱（HPLC）图谱Figure 3 HPLC chromatogram of xavertaoside，isoxavertaoside controls and samples（S1）
2.2.4.2 样品含量测定 取供试品溶液，按拟定色谱条件依法进样分析，记录夏佛塔苷、异夏佛塔苷峰面积，计算含量，结果见表3。5个主要特征峰相对百分含量见图4。
表3 12批霍山石斛枫斗夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量测定结果Table 3 Determination results of the contents of xavertaoside and isoxavertaoside in 12 batches s of D.huoshanense Fengdou
图4 霍山石斛枫斗5个黄酮成分特征峰相对百分含量图Figure 4 Relative percentage content of 5 characteristic peaks of flavonoid components from D.huoshanense Fengdou
2.3 D-甘露糖、D-葡萄糖HPLC柱前衍生含量测定
2.3.1 色谱条件Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流动相为乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，16% A；5～17 min，16%～19% A；17～30 min，19%～22%A；30～35 min，22%～16%A）。流速为1 mL/min，柱温30℃，检测波长250 nm，进样量10μL。
2.3.2 对照品与供试品溶液的制备 同文献研究[10]的制备方法。
2.3.3 方法学考察
2.3.3.1 精密度、稳定性、重复性考察 取供试品溶液（S6），根据“2.1.3”项下方法，按拟定色谱条件进行考察。结果显示，精密度试验RSD为1.8%，重复性试验RSD为2.5%，在0、2、4、8、12、24 h稳定性试验RSD均为2.1%。
2.3.3.2 线性范围考察 精密称取D-甘露糖、D-葡萄糖对照品，制成0.037 5、0.075、0.15、0.3、0.75、1.5、2.25、3.0 mg/mL D-甘露糖和D-葡萄糖系列对照溶液。以对照品浓度为横坐标X，D-甘露糖或D-葡萄糖与D-盐酸氨基葡萄糖内标峰面积的比值（Am/As）为纵坐标Y，进行线性回归，结果显示：D-甘露糖的回归方程为Y=1.003 6X-0.038 0（r=0.999 4），在0.037 5～3.00μg线性关系良好；D-葡萄糖的回归方程为Y=0.792 8X+0.172 4（r=0.999 4），在0.037 5～3.00μg线性关系良好。
2.3.3.3 加样回收率考察 称取6份已知含量的霍山石斛枫斗样品（S6），每份约0.06 g，精密称定，分别加入一定量的对照品，依法制备，进样测定，记录峰面积。结果计算得D-甘露糖、D-葡萄糖平均回收率分别为101.65%、100.74%，RSD均小于3%。
2.3.4 相对校正因子的计算 取D-甘露糖、D-葡萄糖混合对照品溶液10μL，按拟定的色谱条件，分别测定D-甘露糖、D-葡萄糖、内标物的峰面积。计算校正因子f=（mi/Ai）/（ms/As），mi、Ai为被测组分的含量与峰面积。ms、As为内标物的加入量与峰面积，结果显示：D-甘露糖、D-葡萄糖的平均相对校正因子分别为0.939 4、0.959 1，RSD分别为2.0%、1.2%。
2.3.5 样品的测定
2.3.5.1 混合单糖对照品与样品图谱分析 分别取混合单糖对照品溶液与供试品溶液（S6），按照“2.3.1”项下色谱条件进样10μL，分析得到色谱图（见图5）。
2.3.5.2 样品含量测定及峰面积比值分析 记录D-甘露糖、D-葡萄糖和内标物的峰面积，以内标法计算各样品中D-甘露糖含量、D-葡萄糖含量，并计算两者含量之和，以及两者峰面积的比值（A甘/A葡）。结果见表4、图6。
图6 霍山石斛枫斗中D-甘露糖、D-葡萄糖以及两糖之和含量测定结果Figure 6 Determination results of D-mannose and D-glucose contents and their sum in D.huoshanense Fengdou
表4 霍山石斛枫斗中D-甘露糖、D-葡萄糖的含量及其峰面积比值Table 4 Contents and peak area ratio of D-mannose and D-glucose from D.huoshanense Fengdou
3 讨论
从外观性状看，12批霍山石斛枫斗无明显差别，大小、色泽一致，表面呈黄绿色，紧凑弹簧状，环绕紧密，茎基部和茎梢翘出，形如龙头和凤尾，且含水率≤8%。霍山石斛的黄酮类成分主要为黄酮碳苷，这类成分的糖基和苷元可能随着贮存时间的增长更多地结合而含量升高[11-12]。本研究HPLC特征图谱分析结果表明，不同贮藏年份的霍斗黄酮类成分特征峰基本一致，且相似度较高。夏佛塔苷与异夏佛塔苷含量测定结果为0.051 3～0.091 5 mg/g，含量范围符合之前对霍山石斛鲜品的测定结果[13]，且5个特征峰相对百分含量较为一致。霍山石斛单糖主要由D-甘露糖与D-葡萄糖组成[14]，相比于误差较大的总多糖含量测定，两糖含量之和的测定更具有可行性，D-甘露糖与D-葡萄糖含量之和为23.87%～37.19%。此外，从D-甘露糖与D-葡萄糖峰面积之比可以看出，贮存0年和2年的霍斗两糖比例基本相同，而贮存4年和6年的霍斗甘露糖占比更高，这可能与其鲜品的栽培方式有关。
从黄酮类成分特征峰及含量测定，以及多糖含量指标来看，贮藏6年之内的霍斗，其主要黄酮类及多糖成分均较一致，质量良好。同时提示在此种栽培技术下，霍山石斛的遗传性稳定。不同贮藏年限霍斗主要成分含量有一定的差异，这可能与栽培年限、栽培环境、采收时间等诸多因素影响有关。此外，可进一步从挥发性成分的变化角度进行不同贮藏年份霍斗的质量分析。
