烟草ACO基因家族鉴定和二氯喹啉酸药害条件下的表达分析

朱丽颖，陈 凯，汪耀富，李泽锋，谢小东，潘 婷，杨小年，蒲文宣，曹培健，杨 军，罗朝鹏*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001 2.湖南中烟工业有限责任公司技术中心，长沙市雨花区劳动中路386号 410007

二氯喹啉酸是一种生长素类除草剂，广泛用于稻田中杂草的防治。由于常年大量使用此除草剂，近年来在湖南、广东和江西等烟稻轮作区陆续出现烟草二氯喹啉酸药害问题［1-2］。二氯喹啉酸药害在烟草上的症状主要表现为烟叶叶尖和叶缘向叶背卷曲，叶片变厚变窄，严重时呈线状叶形。药害主要发生在团棵至旺长期。若在烟草团棵期前发生药害将会造成烟叶绝收；旺长期发生药害，则会造成烟叶产量下降。药害还可造成烟叶品质明显降低，烟叶总糖、还原糖和钾含量降低，烟碱和淀粉含量明显提高，烟叶化学成分不协调，工业可用性降低［2］。因此，烟草二氯喹啉酸药害已成为影响我国烟叶生产的重要问题之一。

二氯喹啉酸药害机制可能与乙烯合成相关。该药剂施用后，猪殃殃［3］、马唐［4］和稗草［5］中乙烯含量均大幅增加，而相应的抗性株系乙烯含量却无明显变化。因此通过抑制乙烯的合成，能够减轻二氯喹啉酸的药害症状［4-5］。乙烯是一种重要的植物激素，可调控植物种子休眠、萌发、营养生长、开花、果实成熟和叶片衰老等生理过程，在抵御生物和非生物胁迫中乙烯也发挥重要作用［6］。高等植物乙烯合成起始于甲硫氨酸，在腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）催化下合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），然后在1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）作用下合成1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC），最后经过ACO催化生成乙烯［7］。因此ACS和ACO是乙烯合成的限速酶［8］。ACO是2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族里的一个小家族，含有2OG-FeII_Oxy（PF03171.15）和DIOX_N（PF14226.1）两个保守结构域［9］。现已完成ACO基因家族鉴定的植物有拟南芥、水稻、番茄［8］和棉花［10］等，而烟草ACO基因家族的系统鉴定与分析尚未见报道。为此对普通烟草、林烟草和绒毛状烟草ACO基因家族进行了鉴定，并对二氯喹啉酸药害条件下的表达模式进行了分析，旨在明确烟草二氯喹啉酸药害的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

以盆栽K326为材料，在5片真叶期进行二氯喹啉酸处理，二氯喹啉酸浓度为0.2 mg/kg（75%可湿性粉剂，成都科利隆生化有限公司），每株烟浇灌20 mL二氯喹啉酸溶液，分别在处理2 h、6 h、1 d、7 d和14 d后采集烟草叶片和根组织，以未处理的烟株（浇灌同等体积的清水）为对照，以0 h表示。每个时间点取样3株，每株为1次生物学重复。

IMAGENE GenePure Plus多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒和KEMIX 2×SYBR Green qPCR试剂盒（北京密码子生物科技有限公司）；AMV反转录酶［宝生物工程（大连）有限公司］；荧光定量PCR仪（CFX96，美国Bio-rad公司）。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草ACO基因家族鉴定和基本特征分析

根据文献［8］报道的拟南芥和番茄ACO蛋白序列，搜索烟草基因组数据库（BLASTP，Expectation值＜100），将匹配的序列进行家族保守结构域分析（http://pfam.xfam.org/），鉴定获得普通烟草、林烟草和绒毛状烟草ACO家族基因。利用在线软件Compute pI/Mw（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）预测蛋白质分子量和等电点。使用WoLF PSORT软 件（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）进行亚细胞定位预测。

1.2.2 系统进化分析

使用MEGAX软件进行多序列比对和系统进化树构建。其中，多序列比对使用MUSCLE法；系统进化树构建采用邻接法，以Poisson Model和Pairwise Deletion进行分析，Bootstrap检验设置为1 000，其他参数为默认。

1.2.3 MicroRNA靶点分析

使用在线数据库psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）进 行miRNA靶 点 预 测，Expectation值设置为≤4，其他参数为默认值。

1.2.4 启动子分析

用于启动子分析的序列选择起始密码子上游2000bp。使用PlantCARE数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子顺式作用元件分析。

1.2.5 基因表达模式分析

根据普通烟草ACO基因的CDS序列，使用在线软件Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）进行引物设计，设计要求参考2×SYBR Green qPCR Mix试剂说明书。第一链cDNA合成以Oligo（dT）为引物，内参基因引物序列为26s-F：5′-GAAGAAGGTCCCAAG GGTTC-3′和26s-R：5′-TCTCCCTTTAACACCAACG G-3′。qPCR引物序列如表1所示，扩增程序参考2×SYBR Green qPCR Mix试剂说明书。使用2-ΔΔCT法进行相对表达量分析［11］。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 烟草ACO家族鉴定及基本特征分析

根据拟南芥和番茄ACO家族蛋白序列，分别从普通烟草、林烟草和绒毛状烟草基因组中鉴定出19、9和10个ACO家族蛋白，基本特征如表2所示。这些蛋白均含有该家族保守结构域2OG-FeⅡ_Oxy（PF03171.15）和DIOX_N（PF14226.1）。在普通烟草中有15个ACO基因定位在染色体上，其中7和11号染色体上的数量最多，各有3个。有4个基因定位在scaffold上。林烟草和绒毛状烟草基因组未组装至染色体上。

普通烟草ACO基因外显子有2～4个。CDS长度范围为888～966 bp，编码的蛋白长度为295～321 aa，分子量大小为33.45～36.56 kDa。等电点大小为4.62～6.29。在普通烟草中除Ntab0970910外，其他ACO均定位于细胞质。林烟草ACO外显子数为3～4个。CDS长度为906～963 bp，编码蛋白长度为301～320 aa，分子量大小为34.33～36.39 kDa，等电点大小为4.82～6.19，林烟草ACO全部定位于细胞质。绒毛状烟草ACO外显子数为1～4个，CDS长度为741～966 bp，编码的蛋白长度为246～321 aa，分子量大小为28.31～36.56 kDa，等电点大小为4.84～6.68，绒毛状烟草ACO也全部定位于细胞质。因此，3种烟草ACO几乎全部定位于细胞质中，与拟南芥等植物上的研究结果一致［8］。

表2 烟草ACO蛋白家族基本特征Tab.2 Essential characteristics of tobacco ACO family

2.2 系统进化分析

使用来源于普通烟草、林烟草、绒毛状烟草、番茄和拟南芥的50条蛋白序列构建系统进化树。结果（图1）显示，ACO家族进化形成3类，分别为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类，与拟南芥、水稻和番茄［8］的分类结果相同，但和棉花的分类结果不同。在棉花中ACO家族进化形成4类［10］。在烟草中Ⅰ类成员最多，包括13个普通烟草ACO，6个林烟草和7个绒毛状烟草ACO。在Ⅲ类中，普通烟草、林烟草和绒毛状烟草分别有4个、2个和2个成员。Ⅱ类成员最少，普通烟草、林烟草和绒毛状烟草分别只有2个、1个和1个成员。

图1 烟草ACO蛋白家族系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of tobacco ACO family

2.3 MicroRNA靶点分析

对普通烟草ACO基因miRNA靶点的分析结果（表3）显示，有6个ACO存在miRNA靶点，其中Ntab0147840含 有nta-miR396a、nta-miR396b、nta-miR396c和nta-miR6144 4个miRNA的靶点，Ntab0602500含有3个靶点，Ntab0220520含有2个靶点，Ntab0182750、Ntab0582680和Ntab0884340各含有1个靶点。靶点可及性代表了结合和切割靶位点所需的能量，数值越低表示miRNA与靶点相互作用的可能性越大［12］。Ntab0182750和nta-miR6020a-5p，Ntab0147840和nta-miR396a、nta-miR396b、ntamiR396c、nta-miR6144间靶点可及性都较低（＜20），因此这5个靶点和miRNA存在相互作用的可能性很大。

2.4 启动子分析

启动子区顺式作用元件分析结果（表4）显示，普通烟草ACO含有激素反应、低温反应、抗性和胁迫反应、损伤反应和干旱诱导等不同种类的顺式作用元件。激素反应包括5种激素10种类型的顺式作用元件，其中生长素反应元件为TGA-element、TGA-box和AuxRR-core；赤霉素为GARE-motif、P-box、TATCbox；茉莉酸为CGTCA-motif、TGACG-motif；脱落酸为ABRE；水杨酸为TCA-element。脱落酸反应元件ABRE无论是含有的基因数量还是元件总数均最多，有17个基因共含有38个ABRE元件。此外，ACO还含有低温反应（LTR）、抗性和胁迫反应（TC-rich repeats）、损伤反应（WUN-motif）和干旱诱导（MBS）等顺式作用元件。可见，普通烟草ACO表达可能受生长素、赤霉素和茉莉酸等激素调控，也可能响应低温、干旱胁迫和损伤等。

表3 烟草ACO的miRNA靶点预测Tab.3 Prediction of miRNA target sites of NtACO

表4 普通烟草ACO启动子顺式作用元件分析Tab.4 Cis-elements analysis of NtACO promoter

2.5 表达模式分析

图2 普通烟草ACO家族表达分析Fig.2 Expression analysis of NtACO family

相对表达分析结果（图2）显示，普通烟草ACO家族所有成员都受二氯喹啉酸诱导上调表达。其中Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab022 0520 4个基因上调幅度最大，分别上调89、79、65和56倍。在不同组织中比较，大部分基因在叶片中上调幅度较大，在根系中上调幅度相对较小。而Ntab0970910、Ntab0582680、Ntab0141030、Ntab01 47840和Ntab0027650 5个基因在根系中的表达量却高于叶片，特别是Ntab0141030和Ntab0147840在根系中的表达量显著高于叶片，其最大表达量是叶片的1.9和2.9倍。在不同时间点，有8个基因在浇灌二氯喹啉酸溶液后24 h时表达量最高，6个基因在药剂处理后7 d表达量最高。表达量最高的4个基因，最大表达量均出现在药剂处理后7 d。

3 讨论

在杂草对二氯喹啉酸抗性机制中，乙烯生物合成途径发挥了关键作用。ACS和ACO是乙烯合成途径的关键酶。二氯喹啉酸处理后，敏感型无芒稗（Echinochloa crus-galli var.mitis）2个ACS和3个ACO的表达量提高10倍，乙烯含量增加4.1倍，而无芒稗抗性生物型的基因表达量和乙烯含量均增加较少。无芒稗抗性生物型的乙烯产生量与抗性水平成负相关，与生长抑制成正相关［13］。使用二氯喹啉酸处理马唐，马唐敏感型植株乙烯含量提高3倍，而马唐抗性生物型植株乙烯含量没有明显变化。使用乙烯合成抑制剂进行处理，马唐敏感型的乙烯含量下降了89%，药害症状减轻37%［4］。说明通过抑制ACO表达，从而抑制乙烯合成，能够减轻药害症状，增加对药害的抗性。本研究中发现，普通烟草ACO家族所有成员都受二氯喹啉酸诱导上调表达。其中，Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab0220520 4个基因上调幅度超过50倍，推测这4个基因可能在烟草二氯喹啉酸药害引起的乙烯合成中发挥关键作用。

microRNAs（miRNAs）是一类长度约为18～24 nt的内源非编码RNA，通过碱基互补的方式降解mRNA或抑制mRNA转录，在植物生长发育和抗性反应中发挥负调控作用［14-16］。其中，miR396是植物中最保守的miRNA家族，该家族成员数量多，功能涉及非生物抗性［17］。有研究发现，miR396家族成员miR396b与柠檬的抗寒性相关，并且miR396b的靶基因是ACO［18］。过表达miR396b，靶基因ACO被降解，乙烯合成受到抑制，而柠檬的抗寒性提高。本研究中对普通烟草ACO潜在的miRNA靶点进行分析，发现在Ntab0147840和Ntab0602500中都存在nta-miR396a、nta-miR396b和nta-miR396c 3个miR396家族成员的靶点，推测烟草miR396可能通过调控Ntab0147840和Ntab0602500的表达影响乙烯合成，进而影响烟草对非生物胁迫的抗性。这种推测还需要进一步试验验证。

4 结论

普通烟草、林烟草和绒毛状烟草分别含有19、9和10个ACO家族成员，几乎所有蛋白均定位于细胞质中。烟草ACO家族进化形成三类，Ⅰ类成员最多，Ⅱ类成员最少。普通烟草6个ACO中含有潜在的miRNA靶点。启动子区含有激素反应、低温反应、抗性和胁迫反应、损伤反应及干旱诱导等多种类型的顺式作用元件。普通烟草ACO家族所有成员均受二氯喹啉酸诱导而上调表达。