当归补血汤促进大鼠骨质疏松性骨折愈合及调节Wnt/β-catenin 通路作用研究

李 畅，范 荣，李东波，周 威，黄玉娥

（三亚市中医院急诊骨外科，海南 三亚 572000）

骨质疏松性骨折是目前临床中常见的疾病，主要与年龄、性别、营养摄入及基础疾病有关[1]。患者由于内分泌疾病、肾功能疾病及长期使用激素类药物等多种原因导致骨质疏松，随着病情进展，患者由于非外伤或外伤发生骨折的风险显著增加，且预后较差，导致患者长期活动受限，进而引发全身感染性疾病[2]。研究[3]表明，Wnt/β-catenin 通路及相关蛋白水平的降低与骨质疏松性骨折的发生及发展密切相关，曹燕明等[4]研究证实，β-catenin 蛋白水平的降低与骨质疏松性骨折的发生密切相关；王斌等[5]研究表明，Wnt 及β-catenin 蛋白水平的降低诱导并加重骨质疏松性骨折的发生及进展。当归补血汤是以中医理论为基础，由当归、黄芪等中药材组成的中药制剂，具有补血功效，常用于治疗血虚阳浮等病症。近年来，现代医学研究表明当归补血汤对于骨质疏松及骨折的愈合均有显著的改善作用，谢青等[6]研究表明，当归补血汤能够显著改善骨折患者的隐形失血，减少并发症，加速骨关节功能的恢复；陈焕杰[7]研究发现，当归补血汤能够显著改善骨折患者踝关节及膝关节功能状态，缓解患者疼痛状态，促进骨折愈合，由此可见当归补血汤对于骨折愈合有较好的促进作用，然而，当归补血汤对于骨质疏松性骨折愈合的促进作用及对Wnt 及β-catenin 通路的调节作用目前尚未见明确报道。本研究通过探讨当归补血汤对大鼠骨质疏松性骨折的修复作用及其作用机制，为当归补血汤的药理作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 72 只雌性SD 大鼠，6～8 周龄，体质量180～200 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0011，饲养于实验动物房，温度22～25 ℃，相对湿度40%～70%，自然光照，自由饮食，适应性饲养1 周。

1.2 药品及试剂 当归补血汤由黄芪30 g（货号：191017），当归6 g（货号：190911）组成，药材饮品购自北京同仁堂药业有限公司，将药材饮品置于1 500 mL 蒸馏水中浸泡2 h，煎煮45 min，过滤后将药材残渣置于1 000 mL 水中，再次煎煮45 min 后，过滤，合并2 次滤液，蒸发浓缩，制成生药含量为1 g/mL 的制剂；骨组织蛋白提取试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号：HR0117）；阿仑膦酸钠（石药集团欧意药业有限公司，规格：10 mg，批号：20190809）；Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin、GAPDH 单克隆抗体（艾博抗贸易有限公司，货号：ab219412、ab109416、ab236639、ab32572、ab181602）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（碧云天生物科技有限公司，货号：P0012、A0208）；RNA 提取试剂盒、cDNA 逆转录试剂盒、HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：R1200、K1672、G1120）；PCR 引物设计及合成（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3 设备与仪器 EXA -3000 双能X 线骨密度检测仪（澳思托医疗器械有限公司）；HY -0350 万能生物力学试验机（上海衡翼精密仪器有限公司）；5427 R 台式高速冷冻离心机（艾本德中国有限公司）；SpectraMax iD5 酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；MyGo Pro PCR 仪（英国IT-IS 公司）；IX83 荧光倒置显微镜（奥林巴斯有限公司）；E-Gel Imager 凝胶成像仪（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.4 分组、造模及给药 72 只大鼠随机分为正常对照组（12 只）及造模组（60 只），参照文献[8]方法，将造模组大鼠麻醉后从背部作切口，去除双侧卵巢，正常对照组大鼠只做切口但不摘除卵巢，消毒并逐层缝合后，给予70 mg/kg 的头孢呋辛预防感染，12 周后，测定大鼠骨密度，以造模组大鼠骨密度显著低于正常对照组视为造模成功。在造模组大鼠右后肢外侧作一切口，将股骨中段横行锯断，使用直径为1 mm 的克氏针固定后缝合。将造模组大鼠随机分为骨质疏松性骨折组、当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组，12 只/组。当归补血汤低、中、高剂量组分别按照2.5、5、10 g/kg[9]（以生药含量计）的剂量灌胃给予大鼠当归补血汤，阿仑膦酸钠组按照0.5 mg/kg[10]灌胃给予大鼠阿仑膦酸钠，正常对照组及骨质疏松性骨折组大鼠灌胃给予生理盐水，每日1 次，连续给药8周[11]。

1.5 大鼠骨密度的测定 大鼠使用10%水合氯醛麻醉后置于双能X 线骨密度检测仪，检测各组大鼠右后肢股骨密度。

1.6 大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平测定 每组取6 只大鼠，麻醉后取仰卧位，腹主动脉取血至干净离心管中，4℃静置1 h 后，置于4℃离心机中，8 000 r/min，离心10 min，取上清，使用TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒测定大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平。

1.7 大鼠血清ALP、OC 水平测定 每组取6 只大鼠，眼眶静脉丛取血至干净离心管中，4℃静置1 h 后，置于4 ℃离心机，6 000 r/min，离心10 min，取上清液，使用大鼠ALP 及OC 检测试剂盒测定大鼠血清ALP、OC 水平。

1.8 大鼠股骨弹性模量、最大应力、最大承受力测定 每组取6 只大鼠，颈椎脱臼法处死后分离右后肢股骨，使用万能生物力学试验机检测大鼠股骨弹性模量、最大应力、最大承受力等生物力学指标。

1.9 大鼠股骨病理学检查 每组取6 只大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠后，分离右侧股骨，在4%中性甲醛中固定48 h，然后在10%乙二胺四乙酸中脱钙2 周，使用石蜡包埋机包埋后，进行5 μm 切片，常规苏木精-伊红（HE）染色后，在显微镜下进行组织病理学检查。

1.10 大鼠股骨Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平测定 每组取6 只大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠后，分离右侧股骨，在液氮中研磨，使用RNA 提取试剂盒提取总RNA，并使用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，根据引物序列，使用PCR 试剂盒，测 定Wnt3a、DKK1、Runx2、β-catenin 及GAPDH mRNA 水平，结果以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因表达水平。PCR 引物序列：Wnt3a，正向引物5’-GCAGCTGTGAAGTGAAGAC-3’，反向引物5’-GGTGTTTCTCTACCACCATCTC-3’；DKK1，正向引物5’-AGTGGGAACCGAAGAAGAAG-3’，反向引物5’-GACGGGAACTGACTGGATGAAC-3’；Runx2，正向引物5’-GTGTGTGAAAAGCCCGTGTC-3’，反向引物5’-GCACAAGGTTCTGGCAGTTG-3’；β-catenin，正向引物5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’，反向引物5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；GAPDH，正向引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反向引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。

1.11 大鼠股骨Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平测定 每组取6 只大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠后，分离右侧股骨，在液氮中研磨，使用骨组织蛋白提取试剂盒提取总蛋白，使用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白含量后，取相当于50 μg 蛋白的股骨组织样品，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯膜上，使用封闭液室温封闭1 h，分别用Wnt3a、DKK1、Runx2、β-catenin 及GAPDH 兔单克隆抗体（1: 1 000 稀释）在4℃条件下孵育过夜，使用含吐温的磷酸盐缓冲液清洗3 次，每次5 min，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1: 2 000 稀释）室温孵育2 h，再次用含吐温的磷酸盐缓冲液清洗3 次，滴加超敏化学发光液，置于凝胶成像仪中拍照，并使用ImageJ 1.8.0 进行灰度值分析，计算各蛋白相对表达量。

1.12 统计学方法 所有数据采用SPSS 26.0 进行处理和分析，计量资料以均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠骨密度的影响 与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠骨密度显著降低（P＜0.05）；与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠骨密度显著升高（P＜0.05），且随着当归补血汤剂量的增加，大鼠骨密度逐渐升高。见表1。

2.2 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠血清TNF-α、IL-1β 的影响 与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平显著升高（P＜0.05），与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平显著降低（P＜0.05），且随着当归补血汤剂量的增加，大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平逐渐降低。见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平比较 pg/mL

2.3 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠血清ALP、OC的影响 与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠血清ALP、OC 水平显著升高（P＜0.05），与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠血清ALP、OC 水平显著降低（P＜0.05），且随着当归补血汤剂量的增加，大鼠血清ALP、OC 水平逐渐降低。见表3。

表3 各组大鼠血清ALP、OC 水平比较

2.4 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠骨生物力学的影响 与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠弹性模量、最大应力及最大承受力显著降低（P＜0.05），与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠弹性模量、最大应力及最大承受力显著升高（P＜0.05），且随着当归补血汤剂量的增加，大鼠弹性模量、最大应力及最大承受力逐渐升高。见表4。

表4 各组大鼠弹性模量、最大应力及最大承受力比较

2.5 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠股骨病理学的影响 正常对照组大鼠股骨组织结构正常，未见明显病理学变化，与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠股骨组织骨小梁减少；与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤各剂量组阿仑膦酸钠组大鼠骨小梁逐渐增多，空骨陷窝明显减少，股骨组织骨质疏松性病理组织变化明显改善。见图1。

图1 大鼠股骨病理学检查（HE，×200）

2.6 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平的影响 与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平显著降低（P＜0.05），与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平显著升高（P＜0.05），且随着当归补血汤剂量的增加，大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平逐渐升高。见表5。

表5 各组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平比较

2.7 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平的影响 当归补血汤对骨质疏松性骨折大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2及β-catenin 蛋白水平的影响显著降低（P＜0.05），与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2及β-catenin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），且随着当归补血汤剂量的增加，大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平逐渐升高。见表6，图2。

图2 大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平比较

表6 各组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平比较

3 讨论

骨质疏松主要发生在中老年人群中，由内分泌疾病、慢性肾脏病及血液系统疾病等多种病因引起的骨密度及骨质量下降，临床中以骨微结构破坏及骨脆性增加为主要病理特征。骨质疏松患者骨脆性增加，骨折是骨质疏松患者常见的并发症，且骨质疏松性骨折的发生率高，预后差，进而导致患者活动受限，生活不能自理，增加患者肺部感染及褥疮的发生风险，严重影响患者的生活质量[12]。

当归补血汤载于中医学著作《内外伤辨惑论》，具有补气生血的功效。方中黄芪具有滋阴补血、补脾益气的功效，当归则具有养血和营、浮阳秘敛的功效。近年来，研究发现当归补血汤对于骨折愈合具有显著的促进作用。焦明海[13]研究表明，当归补血汤能够显著缓解骨折患者疼痛、肿胀等症状，减少患者疼痛的发生；吴兴辉等[14]研究表明，当归补血汤能够显著提高骨折术后患者的血红蛋白及红细胞比容，减轻患者贫血表现，促进骨折愈合；邓海峰等[15]研究发现，当归补血汤能够显著升高股骨粗隆间骨折术后患者血红蛋白水平，并促进骨折术后的愈合；郭华洋等[16]研究表明，当归补血汤能够显著提高骨折患者术后髋关节功能，降低患者隐性失血的发生风险。由此可见，当归补血汤对于骨折的愈合具有显著的促进作用。

骨密度是评价骨质疏松的重要指标，骨密度降低提示骨质疏松发生或其发生风险增加[17]。本研究结果表明，与正常对照组比较，骨质疏松性骨折大鼠骨密度显著降低，提示造模成功，与骨质疏松性骨折大鼠比较，当归补血汤各剂量组大鼠骨密度呈剂量依赖性显著升高，促进骨质疏松的恢复。弹性模量、最大应力及最大承受力是评价骨生物力学的重要指标，弹性模量、最大应力及最大承受力降低表明骨组织生物力学显著降低及骨组织功能减退[18]。本研究结果表明，与正常对照组比较，骨质疏松性骨折大鼠弹性模量、最大应力及最大承受力均显著降低，给予大鼠不同剂量的当归补血汤后，大鼠弹性模量、最大应力及最大承受力随当归补血汤剂量的增加而逐渐升高，提示当归补血汤能够呈剂量依赖性的显著修复骨质疏松性骨折大鼠的骨组织功能，恢复大鼠骨生物力学指标，促进骨折大鼠的修复。

血清ALP、OC在骨组织损伤恢复中发挥重要作用，李希宁等[19]研究表明ALP、OC 水平的升高是导致骨质疏松及骨组织损伤的重要因素，并能够抑制成骨细胞的组织分化，抑延缓骨组织的愈合速度；陈洪燕等[20]研究表明，降低大鼠ALP、OC 水平能够促进新骨的形成，升高骨密度水平。本研究结果表明，给予骨质疏松性骨折大鼠不同剂量的当归补血汤后，大鼠血清ALP、OC 水平呈剂量依赖性显著降低，提示当归补血汤能够呈剂量依赖性显著调节骨代谢，促进大鼠骨组织结构和功能的恢复。TNF-α、IL-1β 水平对于骨折的愈合有较大影响，刘明等[21]研究表明，TNF-α、IL-1β水平的升高会减缓大鼠骨折愈合速度。本研究结果表明，骨质疏松性骨折大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平显著升高，给予大鼠当归补血汤后，骨质疏松性骨折大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平呈剂量依赖性显著降低，提示当归补血汤能够呈剂量依赖性显著降低骨质疏松性骨折大鼠的炎症反应，缓解大鼠体内炎症状态，促进骨折的愈合。

Wnt/β-catenin 通路与细胞增殖、生长及代谢有关，近年来，研究表明Wnt/β-catenin 通路及相关蛋白水平异常与骨折的发生及愈合有关，史岩等[22]研究发现，上调骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin 通路相关蛋白水平，能够显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化，对骨折愈合有显著的促进作用；丁徐等[23]研究表明，鸡血藤能够通过提高骨质疏松性骨折大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白水平，提高大鼠骨密度，促进大鼠最大载荷及抗弯强度等骨生物力学的恢复；黄晓文等[24]研究表明，升高Wnt/β-catenin 通路相关蛋白水平能够显著促进胫骨骨折大鼠骨组织愈合，提高大鼠骨组织愈合评分，并缓解大鼠体内炎症水平，促进大鼠骨折的恢复，由此可见调节Wnt/β-catenin 通路及相关蛋白水平可能是促进骨折恢复及治疗骨质疏松性骨折的有效途径和方法。本研究探讨不同剂量当归补血汤对骨折大鼠的修复作用，发现与正常对照组比较，骨质疏松性骨折组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平降低，与骨质疏松性骨折组比较，当归补血汤低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2及β-catenin mRNA 水平升高，提示当归补血汤能够呈剂量依赖性的显著提高骨质疏松性骨折大鼠的Wnt/β-catenin 通路相关蛋白水平，激活骨组织Wnt/β-catenin通路，促进骨质疏松性骨折大鼠的恢复。

综上所述，当归补血汤能够显著提高骨质疏松性骨折大鼠的骨密度，改善大鼠骨生物力学指标，调节骨代谢水平，其机制可能与调节Wnt/β-catenin 通路有关。