淋巴细胞亚群动态监测在肺移植患者中的应用价值

马锡慧，米运强，韩永，张娟，李彬钰，孙玉洁，朱蕾，王佳齐，肖漓

（1.中国人民解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部研究所，北京市器官移植与免疫调节重点实验室，北京 100091；2. 联勤保障部队第984 医院，北京 100094）

肺移植是目前公认的治疗各种终末期肺部疾病的有效方式［1］，随着供体选择、器官保存、围术期管理和术后并发症处理的不断改进，患者预后有了明显的改善。但因为肺脏与外界直接相通，更易接触各种病原体和外来物，因此，面临极高的感染风险，肺移植术后5 年内急、慢性排斥反应所致肺功能障碍的发生率也高达50%［2］。但感染和排斥反应的治疗方案相悖，免疫抑制剂的使用与患者的免疫状态密切相关，淋巴细胞亚群是患者免疫状态的直观体现［3］，本文动态监测2 例肺移植受者住院期间淋巴细胞亚群变化情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1病例资料：病例1，男性，55 岁，诊断“矽肺Ⅲ期、间质性肺炎、高血压（3 级，极高危）”，因基础肺功能差，肺部情况处于终末期阶段，具有肺移植指征，于2021 年6 月10 日行VVECMO 辅助下双肺移植术，为本院首例肺移植手术。术后诊疗计划：① 肺功能方面：定期复查血气，监测患者呼吸频率、呼吸幅度、指脉氧饱和度，视患者情况调整辅助呼吸设备的使用。② 循环系统方面：监测心率、血压，维持容量负平衡，适当利尿。③ 抗感染方面：给予预防感染等对症支持治疗，密切注意病原学检查结果。④ 免疫抑制方案和免疫状态：定期监测淋巴细胞亚群和免疫抑制剂血药浓度，及时调整药量。⑤ 消化系统方面：启动肠外营养，注意观察患者消化道症状。⑥ 肾功能方面：监测肾功能变化。⑦ 精神心理方面：床旁心理辅导，缓解患者焦虑。抗排斥反应治疗方案：他克莫司+醋酸泼尼松+吗替麦考酚钠。根据淋巴细胞亚群和免疫抑制剂血药浓度监测结果，从术后第1 天开始先后6 次调整他克莫司胶囊剂量，至术后12 d 确定他克莫司胶囊剂量为3 mg，1 次/12 h，患者肺移植术后病情平稳，未出现感染和排斥反应，经多学科精心诊疗和护理，于术后14 d 出院，出院后就诊无锡市人民医院和无锡市惠山区康复医院进行康复锻炼治疗，康复锻炼2 个月后出院，出院后规律口服他克莫司3 mg，1 次/12 h，醋酸泼尼松片15 mg，1 次/d，吗替麦考酚钠180 mg，1 次/12 h，术后半年返院复查1 次。

病例2，女性，18 岁，诊断“药物中毒（百草枯）、肺间质纤维化、Ⅰ型呼吸衰竭”，该患者2021 年12 月5 日服用“感冒药”后出现恶心呕吐症状，住院治疗期间开始出现间断胸闷气短，逐渐加重。2021 年12 月17 日患者尿液中检测到百草枯70 ng/ml。诊断明确，肺纤维化进展迅速，具有肺移植适应证，患者术前肺组织百草枯残留量为零，术前存在肝功能和凝血功能异常、电解质紊乱、血淀粉酶升高，其他器官功能尚可。于2022 年1 月6 日行VVECMO 辅助下双肺移植术。术后第1 天拔除ECMO 置管及气管插管，给予无创呼吸机及高流量交替应用。术后诊疗计划与病例1 相似，从肺功能、循环系统、抗感染、免疫抑制和免疫状态、消化系统等7 方面进行，并根据百草枯中毒的特点和多器官功能障碍的严重性启动个体化诊疗方案。抗排斥反应治疗方案：患者术前已存在免疫抑制，感染风险高，因此进行了加强抗感染治疗，患者术后第4 天开始服用免疫抑制剂（环孢素A），并根据淋巴细胞亚群和免疫抑制剂血药浓度监测结果及时调整用量和更换免疫抑制剂，术后第7 天更换免疫抑制剂为他克莫司，术后12 d 确定抗排斥治疗方案他克莫司2 mg，1 次/12 h，醋酸泼尼松片20 mg，1 次/d，吗替麦考酚钠180 mg，1 次/12 h，经多学科精心诊疗和护理，患者一般情况可，未出现明显感染和排斥反应，肝脏、肾脏和消化系统功能逐渐恢复，经评估于术后13 d 出院，转至无锡人民医院行康复治疗。

本研究经我院伦理委员会批准，且患者均签署知情同意书。

1.2实验仪器与实验材料：实验仪器包括流式细胞仪（BD 公司，型号FACS Canto Plus），多管架平衡离心机（湘仪，型号TDZ5 -WS），涡旋混匀器（Thermo，LP vortex Mixer）。实验材料包括移液器及枪头一套、绝对计数管（BD 公司，型号Trucount）、淋巴细胞亚群检测试剂6-color TBNK Reagent（BD 公司，型号MultitestTM REF 644611）、10×FACS 溶血素（BD 公司）、FACS 7 色设置微球（BD 公司）。样本为EDTA 抗凝外周全血。

1.3实验方法：将20 μl 淋巴细胞亚群检测试剂（CD3/CD8/CD45/CD4/CD16+56/CD19）移到绝对计数管的底部。采用反向移液法吸取50 μl 充分混匀的乙二胺四乙酸抗凝外周全血，加入绝对计数管底部，震荡混匀后室温避光孵育15 min。每管加入450 μl 溶血素（10×FACS 溶血素∶蒸馏水＝1 ∶10），充分混匀之后，室温避光孵育15 min。采用流式细胞仪检测样本中的淋巴细胞亚群，采用Canto 软件获取和分析淋巴细胞亚群比例和绝对计数。

1.4 观察指标：观察肺移植受者术前及术后送检的淋巴细胞亚群的表达变化，确定患者免疫状态，及时调整治疗方案，评估淋巴细胞亚群动态监测在肺移植受者的应用价值。

2 结 果

2.1 2 例患者在肺移植前后不同时间点的淋巴细胞亚群比例和绝对计数（表1、表2）。

表1 病例1 在肺移植前后不同时间点的淋巴细胞亚群比例和绝对计数

表2 病例2 在肺移植前后不同时间点的淋巴细胞亚群比例和绝对计数

病例1：术前淋巴细胞亚群在正常水平，术后第9 天开始，T 淋巴细胞（包括CD3+T、CD3+CD4+T和CD3+CD8+T 淋巴细胞）绝对计数恢复至参考值范围内。术后住院期间CD3+CD8+T 淋巴细胞比例和NK 细胞绝对数均低于正常水平、B 淋巴细胞比例均高于正常水平，术后6 个月均已恢复至参考值范围。B 淋巴细胞绝对数均维持在正常水平。CD4/CD8 在术后第8 天开始高于参考值范围。

病例2：术前淋巴细胞亚群严重低于正常水平，CD3+T 和CD3+CD8+T 淋巴细胞绝对计数在术后第7 天恢复至参考值范围。术后住院期间CD3+CD4+T 淋巴细胞比例和绝对计数、CD4/CD8 均低于正常水平，NK 细胞和B 淋巴细胞绝对计数多数时间点低于参考值范围。

2.2 2 例患者淋巴细胞亚群随时间变化 （图1 ～4）：2 例患者淋巴细胞各亚群比例与对应绝对计数随时间变化趋势均不一致。病例1 CD3+CD4+T 淋巴细胞与总（CD3+）T 淋巴细胞比例随时间变化趋势一致。病例2 CD3+CD8+T 淋巴细胞与总（CD3+）T淋巴细胞比例随时间变化趋势一致。

图1 患者淋巴细胞亚群随时间变化

图2 患者淋巴细胞亚群随时间变化

3 讨 论

肺移植目前已经成为公认的治疗终末期肺部疾病的一种有效方法［1］，同其他实体器官移植一样，防治排斥反应和感染一直是肺移植的两大难点［4］，同时肺脏作为一个开放的器官，直接与外界相通，因此其感染和排斥反应的发生情况较其他器官更为复杂，这也是导致肺移植生存率低于其他器官移植的原因之一［5］，及时评估肺移植受者免疫状态，有效预防感染和排斥反应尤为重要，淋巴细胞亚群作为评估机体免疫状态的指标越来越受到临床医生的重视，尤其是淋巴细胞亚群绝对计数，因其能更准确地反映某种淋巴细胞的数量变化，而不受其他亚群的影响，因此，淋巴细胞亚群绝对计数能更准确地反映机体的免疫功能高低水平。

本研究中病例1 为职业矿工，接触煤矿、金矿及打隧道15 年，2019 年经当地职业病防治研究院诊断为“职业性矽肺Ⅲ期”，该患者肺移植术前存在高碳酸血症，FEV1＜30%预计值且1 年内快速下降，肺脏弥散功能无法完成，影像学有严重的特征性改变，反复发作性气胸，具有明显肺移植适应证，且有研究报道肺移植治疗Ⅲ期矽肺效果良好，术后患者可长期存活［6］。

病例1 淋巴细胞亚群结果显示：该患者术后3 d、4 d 总（CD3+）T 淋巴细胞、CD3+CD4+T 淋巴细胞、CD3+CD8+T 淋巴细胞、NK 细胞处于严重低下状态，结合免疫抑制剂血药浓度监测结果，将他克莫司剂量（初始剂量3 mg，2 次/d）先后调整为1.5 mg，2 次/d 及1 mg，2 次/d。术后5 d 总T 淋巴细胞、CD3+CD4+T 淋巴细胞、CD3+CD8+T 淋巴细胞、NK 细胞绝对数持续回升，术后8 d 总T 淋巴细胞、CD4/CD8 升高明显，为防止排斥反应发生，结合血药浓度、血常规及临床表现，术后7 d、8 d先后调整他克莫司剂量为2 mg 2 次/d、早2 mg 晚2.5 mg。术后9 d 开始，总T 淋巴细胞继续升高至参考值范围，术后11 d、13 d 总T 淋巴细胞绝对计数相对稳定，因此术后9 d、12 d 先后调整他克莫司剂量为2.5 mg，2 次/d 及3 mg，2 次/d。该患者术后6 个月复查时，淋巴细胞亚群绝对计数已恢复至正常，这与练巧燕等［7］的研究结果一致。王宇成等［8］的研究表明，肾移植术后急性排斥反应患者CD4/CD8 明显升高，值得注意的是，该肺移植患者术后8 d CD4/CD8 持续高于参考值范围，应持续动态监测淋巴细胞亚群及其他检查指标，以防出现肺移植术后排斥反应。

本研究中病例2 为百草枯中毒患者。百草枯是一种广泛使用的有机杂环类接触性脱叶剂和除草剂。急性百草枯中毒截至目前仍无特效治疗方法，病死率高达50%～70%［9］。百草枯中毒引起肺、肝、肾、心、脑等多脏器功能障碍［10］，它的主要靶器官是肺脏，通过复杂的分子机制最终引起肺纤维化。许多报道显示［11-12］，肺移植已成为目前治疗肺间质纤维化的有效治疗方式，甚至是最后的选择。而肺移植也成为致死剂量百草枯摄入后目前唯一有效的治疗方法［13］。

该患者术前已进行4 次甲泼尼龙琥珀酸钠联合环磷酰胺冲击治疗联合常规免疫抑制治疗，淋巴细胞亚群结果显示患者存在严重免疫抑制，术后即加强抗感染治疗且暂未使用免疫抑制剂。患者术后4 d 淋巴细胞亚群结果显示总T 淋巴细胞、CD3+CD4+T 淋巴细胞、CD3+CD8+T 淋巴细胞较前升高，为防止排斥反应发生，经多学科联合评估，术后4 d 开始给予环孢素A（100 mg，2 次/d）免疫抑制治疗。术后6 d、7 d 根据血药浓度和淋巴细胞亚群结果，先后提高环孢素A 剂量（150 mg，2 次/d）和更换环孢素A 为他克莫司（2 mg，2 次/d）。

该患者总T 淋巴细胞和CD3+CD8+T 淋巴细胞绝对计数在术后第7 天恢复至参考值范围，而CD3+CD4+T 淋巴细胞绝对计数、CD4/CD8 在住院期间均持续低于正常水平，有研究表明外周血CD4+T淋巴细胞的变化与肾移植术后早期严重肺部感染的转归密切相关［14］，，因此应警惕该患者感染的发生。术后7 d 以后，CD3+CD8+T 淋巴细胞比例开始偏高而CD3+CD4+T 淋巴细胞比例持续偏低，结合绝对计数结果，说明CD3+CD8+T 淋巴细胞比例属于反应增高，CD3+CD4+T 淋巴细胞的抑制程度更高，恢复更慢，该患者术后13 d 内CD3+CD4+T淋巴细胞和B 淋巴细胞绝对计数多数时间点低于参考值范围，因患者术后时间较短。因此，本研究暂未获得该患者的淋巴细胞亚群随访数据，应继续进行淋巴细胞亚群动态监测，以及时了解患者机体免疫状态恢复情况，避免发生严重感染。

2 例患者淋巴细胞亚群随时间变化图显示：淋巴细胞各亚群比例与对应绝对计数随时间变化趋势均不一致。说明：淋巴细胞亚群绝对计数能更准确地反映机体的免疫状态，二者结合可以直观地反映机体的免疫程度和变化趋势。病例1 CD3+CD4+T 淋巴细胞与总（CD3+）T 淋巴细胞比例随时间变化趋势一致，说明CD3+CD4+T 淋巴细胞是引起总T 淋巴细胞变化的主要因素。病例2 CD3+CD8+T 淋巴细胞与总（CD3+）T 淋巴细胞比例随时间变化趋势一致，说明CD3+CD8+T 淋巴细胞是引起总T 淋巴细胞变化的主要因素［15］。

综上所述，通过及时的淋巴细胞亚群检测和免疫力评估，结合其他检查指标，在多学科联合诊疗和护理下，两例肺移植患者围术期均未出现感染和排斥反应，移植肺功能和患者长期存活还需进一步随访研究。同其他实体器官移植一样［16-20］，淋巴细胞亚群在肺移植术后免疫监测中同样发挥着重要的作用，与肺移植患者的个体化诊疗和免疫抑制剂的使用相关。且有研究报道，外周血T 淋巴细胞亚群对于鉴别肺移植术后感染和排斥反应具有一定帮助［21］。另外，淋巴细胞亚群比例和绝对计数联合分析，能够更加全面地反映机体的免疫程度和变化趋势，为临床精准诊疗提供明确的依据。