那西肽提取工艺研究

闵江，娄燕，刘正光，王丹丹，赵才兵，梁景乐,2*

(1.山东胜利生物工程有限公司 山东济宁 272000；2.中牧实业股份有限公司 北京 100095）

那西肽（Nosiheptide），又称诺西肽，是由活跃链霉菌（Streptomyces actuosus）产生的，与Thiostrepton、Siomycin、Sporangiomycin、Thiopeptin、Althiomycin、Taitomycin 等 组 成 了一大类富含硫的多肽类抗生素，既能作为饲料添加剂，明显促进鸡、猪的生长，低浓度时可抑菌，高浓度时能杀菌，还具有抗病毒活性。

那西肽纯品为黄色针状晶体，属于脂溶性抗生素，主要存在于菌体细胞内，最有效的提取方法是有机溶剂萃取。韩正枝等发明了一种亚临界水提取菌丝体中那西肽的方法，发酵液进行过滤、亚临界水进行萃取，提取率达到93%以上，并未提及粗品含量。张春颖采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品，并进一步采用离子交换层析法分离纯化，提取率不低于85.1%，生物效价不低于750U/mg。徐天华等以那西肽菌丝体为原料，采用四氢呋喃为提取溶剂，用中性氧化铝进行初步纯化，经高速逆流色谱纯化，得到含量不低于95%的那西肽产品，回收率为86%。徐天华等采用大孔吸附树脂对那西肽提取工艺进行研究，比较8 种大孔吸附树脂对那西肽粗品所含杂质的吸附能力，经混合树脂纯化后的那西肽产品为淡黄色粉末，纯度最高可以达到99%。本文对那西肽提取工艺进行了系统研究，旨在简化提取工艺路线，保证产品质量，降低提取成本，提出切实可行的工业化生产方案。

1 材料与方法

1.1 原料

那西肽发酵液与那西肽对照品由山东胜利生物工程有限公司提供。

1.2 主要试剂

甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；四氢呋喃（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；二氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；DMF（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC，J.T.Baker）；硫酸铝（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 主要仪器

液相色谱仪Agilentl200（Agilent 公司，美国）；FW-100 型万能粉碎机（上海楚定分析仪器有限公司）；JA31002 型电子天平（上海越平科学仪器有限司）；KDM 型调热电热套（山东鄄城光明仪器有限公司）；Heidolph 4000 旋转蒸发仪（海道夫，德国）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水真空泵（郑州长盛实验仪器有限公司）；xutemp 型低温恒温液浴循环两用槽（杭州雪中炭恒温技术有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 那西肽干菌丝体制备将那西肽产生菌接入种子罐中，种子罐温度为25～29℃，pH 6.8～7.2，经过逐级扩大培养后，按发酵罐体积20%的接种量接入发酵罐中，按发酵液与空气的体积比为1:0.5～1:2 通气，控制温度为25～29℃进行有氧发酵，发酵过程中控制pH 6.8～7.2，发酵周期为240～260h，得那西肽发酵液；

向那西肽发酵液中加入絮凝剂硫酸铝，搅拌60min，硫酸铝加入量占那西肽发酵液体积总量的0.5%，得预处理后的那西肽发酵液，减压过滤，真空干燥，得到那西肽干菌丝体；

1.4.2 那西肽提取工艺

1.4.3 那西肽效价的检测

1）对照品溶液的制备。取那西肽对照品适量（约相当于那西肽12.5mg），置25mL 容量瓶中，加适量DMF 使溶解，稀释至刻度，制成储备液。精密量取5mL 储备液至50mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成约含0.05mg/mL 的对照品溶液。

2）供试品溶液的制备。准确称取那西肽菌丝体0.5g，置于50mL 棕色容量瓶中，加入0.05mol/L 磷酸缓冲液5mL，适量DMF，超声处理20min，冷却至室温后，用DMF 定容。准确移取此溶液1mL 置于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，过滤，制得供试品溶液。

图1 那西肽提取工艺流程图

精确称量那西肽纯品0.05g，放入100mL 容量瓶中加入适量DMF 使溶解，稀释至刻度，制成储备液。精密量取5mL 储备液至50mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成供试品溶液。

精确量取那西肽浸提液1mL，放入100mL 容量瓶中加入DMF 至刻度，制成储备液。精密量取5mL 储备液至50mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成供试品溶液。

3）色谱条件。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.025%磷酸水溶液（50:50）为流动相；检测波长为241nm，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL。

2 结果与讨论

2.1 那西肽在不同溶剂中溶解能力

取适量那西肽菌丝体，在25℃条件下分别用四氢呋喃、90%四氢呋喃溶液、DMF、DMF：0.05mol/L 磷酸缓冲液=9:1、二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇=8:2、60%乙醇溶液、丙酮、液相检测流动相（乙腈：0.025%磷酸溶液=1:1）浸提。利用液相色谱检测浸提液效价，结果见表1。可以看出，90%四氢呋喃溶液浸提那西肽菌丝体效果较好，优于其他溶剂；并发现有水存在时，浸提效果优于纯溶剂，为进一步考察不同浓度四氢呋喃、乙醇、丙酮的浸提效果，取适量那西肽菌丝体，在25℃条件下分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的四氢呋喃溶液、乙醇溶液、丙酮溶液浸提。利用液相色谱检测浸提液效价，结果见表2、表3、表4。可以看出，70%四氢呋喃溶液浸提效果最好，但实验发现70%四氢呋喃溶液浓缩时较慢，存在那西肽降解情况，综合考虑，选用80%四氢呋喃溶液作为浸提溶剂。

表1 不同溶剂中那西肽溶解度

表2 不同浓度四氢呋喃溶液中那西肽溶解度

表3 不同浓度乙醇溶液中那西肽溶解度

表4 不同浓度丙酮溶液中那西肽溶解度

2.2 浸提pH 的选择

文献报道那西肽在酸性及碱性条件下易水解，本文也进行验证，取适量浸提液（pH 约为5.6），分别用氢氧化钾溶液调节pH至2.5、4、6.5、7.0、8.0，结果显示，浸提液效价有明显降低，因此浸提时pH 不需调节。

表5 不同pH下70%甲醇溶液中那西肽溶解度

2.3 浸提温度的选择

取适量那西肽菌丝体，分别在25、35 和45℃条件下用80%四氢呋喃溶液一次浸提；检测浸提液效价，结果见表6。可以看出，温度越高，浸提效果较好。鉴于那西肽稳定性较差，四氢呋喃沸点及闪点较低，不适宜加热等因素，确定25℃（室温）为浸提温度。

表6 不同温度下四氢呋喃溶液中那西肽溶解度

2.4 浸提时间的选择

取适量那西肽菌丝体，在25℃条件下用80%四氢呋喃溶液浸提；分别在0.5、1 和2h 取样检测浸提液效价，结果见表7。考虑到时间成本与浸提率，浸提时间可以选用1h。

表7 不同浸提时间下四氢呋喃溶液中那西肽溶解度

2.5 浸提料液比选择

在25℃条件下，比较不同料液比（m/v）对浸提率的影响，实验结果见表8。考虑到溶剂套用情况、菌渣残留、生产设备承受能力等情况，确定一次浸提料液比为1:7，二次浸提料液比为1:4。

表8 不同料液比对浸提率的影响

2.6 重结晶溶剂用量选择

浓缩液降温析出粗精粉含量约75%左右，需要四氢呋喃搅拌洗涤，考察了不同四氢呋喃用量（vm）洗涤粗精粉的效果，结果显示（表9），四氢呋喃用量（vm）可控制在1.0左右。

表9 不同用量四氢呋喃对那西肽粗精粉质量影响

3 结论

通过对浸提溶剂、浸提pH、浸提温度、浸提时间、料液比、重结晶溶剂用量等单因素研究，确定了那西肽提取的最佳工艺：浸提溶剂为80%四氢呋喃溶液，浸提pH 为7.0，浸提温度为25℃；两次浸提时间都为1h；一次浸提料液比为1:7，二次浸提料液比为1:4；四氢呋喃用量（vm）为1.0 左右，可获得含量高达95%的那西肽纯品。相比较现有的大孔树脂吸附、色谱提取、混合溶剂提取等那西肽的分离纯化方法，此工艺的操作简单易行，只使用一种溶剂，对设备要求较低，另外此工艺稳定可行，所用的溶剂均可回收利用，对环境污染较小，为工业化生产那西肽纯品奠定基础。