内质网应激与病毒感染(综述)

倪敏舒， 陈 丽， 鲍 熹， 恽君雯，3， 徐 悦， 冯 磊

(1.江苏大学药学院，江苏镇江 212013； 2.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，江苏南京 210014； 3.扬州大学，江苏扬州 225009)

1 UPR反应通路介绍

未折叠蛋白反应(UPR)是一种细胞适应性反应，用以恢复内质网稳态以应对内质网应激。通过上调分子伴侣免疫球蛋白重链(BIP)结合蛋白以促进蛋白质折叠，抑制蛋白质合成，增强内质网相关降解(ERAD)，消除错误折叠和未折叠蛋白质。

BIP又被称为葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，是热休克蛋白家族的一员。BIP是UPR反应的标志性分子，静息状态时与3个近端的UPR传感分子结合且抑制其活性。3个UPR传感分子分别为激活转录因子6(ATF6)、RNA-依赖的蛋白激酶样ER驻留激酶(PERK)和Ⅰ型ER转膜蛋白激酶(IRE1)。

当未折叠蛋白及错误折叠蛋白在内质网中堆积时，BIP被错误折叠或未折叠蛋白隔离，断开与UPR传感器的连接，相应激活3条反应通路。BIP在细胞中不仅可作为一种伴侣蛋白，促进蛋白的折叠或组装，在应激反应初期，还可作为检测未折叠或错误折叠的病毒蛋白传感分子。

1.1 ATF6通路

ATF6转录因子是碱性亮氨酸拉链蛋白ATF/cAMP反应元件结合蛋白家族的成员，是一种Ⅱ型内质网跨膜蛋白，其NH末端的DNA结合域面向胞浆，COOH末端位于内质网管腔内。ATF6与BIP断开连接后，移位至高尔基体中，被site-1和site-2蛋白酶切割成活性转录因子。被蛋白酶水解释放的氨基酸末端结构域移位至细胞核中，诱导编码蛋白或折叠酶基因表达，如BIP、葡萄糖调节蛋白94和P58IPK。值得一提的是，ATF6通路的末端分子P58IPK是PERK的抑制剂，因此ATF6通路往往与PERK途径联合研究(图1)。

1.2 PERK-eIF-2α通路

未折叠或错误折叠蛋白的积累激活了PERK通路，PERK在丝氨酸51处磷酸化，随后磷酸化PERK磷酸化eIF-2α，eIF-2α的磷酸化进而诱导激活转录因子4(ATF4)的表达，ATF4是一种刺激C/EBP同源蛋白(CHOP)、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白34(Gadd34)表达的转录因子，其本身也可增加蛋白质分泌，促进细胞存活。

CHOP，也称为生长停滞和DNA损伤诱导蛋白153(GADD153)，是CCAAT/增强子结合蛋白的显性负抑制因子。当在哺乳动物细胞中表达时，CHOP/GADD153促进凋亡。

Gadd34在DNA损伤、生长停滞等条件下表达。相关文献表明，Gadd34是蛋白磷酸酶1的一个调节亚单位，通过羧基末端招募蛋白磷酸酶1。招募到的蛋白磷酸酶1可使eIF-2α去磷酸化，负反馈调节PERK通路，缓解内质网应激的翻译抑制和应激条件的基因表达(图1)。

12）脚手板操作面的端头处绑两道防护栏杆，建筑物顶部脚手架要高出屋面1.0m，高出部分要绑两道护身栏，并立挂安全网。

1.3 IRE1-XBP-1通路

IRE1是一种在细胞质中含有ER羟氨基末端结构域、跨膜区、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和羧基末端核酸内切酶结构域的蛋白质。当超量的错误折叠蛋白质在内质网中堆积，与GRP78结合的IRE1单体释放并二聚化和交叉磷酸化，会激活IRE1作为核酸内切酶的活性，从XBP-1 mRNA中切割去除26个核苷酸内含子，形成移码转录本拼接的XBP-1(XBP-1s)。未剪接的XBP-1(XBP-1u)mRNA编码UPR的抑制因子。XBPIs转录因子激活靶基因，如促进ER降解的α-甘露糖苷样蛋白(EDEM)，该蛋白促进错误折叠蛋白的降解(图1)。

2 内质网应激与自噬和凋亡之间的联系

自噬是一个细胞主要的分解代谢过程，它将蛋白质、细胞质成分和细胞器碎片运送到溶酶体中进行降解循环。目前，已鉴定出30多个自噬相关基因(ATG)精心编码自噬程序。现已证明，PERK-eIF2α 在内质网应激中的自噬诱导中起关键作用，PERK途径下游信号分子ATF4和CHOP在转录过程中上调出超过12个ATG基因。

在IRE1途径中，依赖于肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的激活导致Bcl-2磷酸化，使Beclin-1(一种自噬调节蛋白)解离，进而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合物和自噬。

在内质网应激下，所产生的ERAD主要是通过泛素-蛋白酶系统(UPS)降解被泛素化的未折叠或错误折叠的蛋白，而自噬也是一种非典型的ERAD途径。一些因为形成聚合体或一些特殊结构不能被典型的ERAD机制降解的错误折叠蛋白质，可通过自噬高效的降解去除。如突变的A1-抗胰蛋白酶或错误折叠的促性腺激素释放激素受体(GnRHR)。

与内质网有着密切联系的另一个细胞生理活动是凋亡，细胞为维持内环境稳定，由基因控制程序性死亡。凋亡是细胞面对内环境失调，能够更好地适应环境所选择的主动过程。在凋亡过程中，半胱氨酸蛋白酶家族扮演重要角色。通过半胱氨酸蛋白酶家族成员Caspase-8招募诱导死亡的刺激复合物(DISC)激活凋亡；或通过Caspase-9，在线粒体损伤后介导凋亡信号。当内质网应激长时间处于高度紧张状态而无法缓解时，UPR反应也可最终调控细胞凋亡。因此，内质网应激也被认为是细胞死亡的另一个调控中心。IRE1可招募TRAF2，并反过来招募激活c-Jun N末端激酶(JNK)途径的近端成分ASK。ASK和JNK的长期激活会导致细胞凋亡。内质网调控细胞凋亡的另一条路径是诱导线粒体释放细胞色素和激活Caspase-8途径。Bcl-2/CB5蛋白是一种针对内质网的Bcl-2蛋白，能够抑制内质网应激介导的细胞色素c释放。网格蛋白家族中的RNT-Xs通过内质网与Bcl-2相互作用，可以降低Bcl-2和Bcl-XL在衣霉素诱导的细胞死亡中的抗凋亡活性(图1)。

3 内质网应激和病毒感染

病毒在其感染过程中，合成大量病毒蛋白使内质网处于应激状态。细胞为了维持自身稳态，常常会启动 UPR 介导的蛋白降解途径(ERAD)及宿主细胞凋亡、自噬等调控机制，抑制或降解病毒蛋白的合成和堆积来维持细胞稳态。与此同时，病毒则会通过反调控或利用UPR反应，为其在宿主体内复制增殖提供适宜的环境，最终成功复制。病毒感染引起的持续UPR和炎症反应可能也是病毒疾病的重要病因之一。病毒诱发内质网应激过程中，会特异性调控UPR反应中的某一特定通路，使UPR反应能够以有利于病毒复制；或者通过调控内质网应激所诱导的细胞自噬，缓解细胞自身压力，让细胞免于凋亡，最终实现持续感染。接下来将对几种会诱发内质网应激的病毒作简要概述。

3.1 RNA病毒

3.1.1 登革热病毒(DENV) DENV在病毒感染的不同时期会诱发UPR反应的不同通路，在感染早期激活PERK通路，在感染中期激活IRE1通路，在感染后期激活ATF6通路。通过早期的PERK通路所带来的蛋白质翻译削弱而抑制病毒的复制，可随后该通路被病毒迅速逆转，确保蛋白质的翻译水平，从而顺利装配病毒粒子。中期激活IRE1途径，并且激活XBP-1的靶基因，如EDEM。这类靶基因有利于降解部分蛋白质缓解内质网压力，使细胞免于凋亡，有利于病毒持续感染。XBP-1通路的激活是由ER相关的DENV糖蛋白(PRM、E和NS1)和较小的疏水性ER锚定病毒蛋白(NS2A、NS2B和NS4B)诱导的；并且DENV能够抑制该通路的下游凋亡基因，提高细胞存活率，有利于病毒感染。DENV所介导的内质网应激和UPR会激活细胞自噬反应，在感染过程中PERK途径上调了对维持高自噬水平有着重要作用的活性氧(ROS)，有利于产生成熟和具有感染性的病毒颗粒。而自噬的激活过程中，所形成的双膜小泡为病毒复制提供平台，最终使细胞内外的病毒载量提高，同时促进细胞脂质的氧化，为病毒提供三磷酸腺苷。总之，DENV所诱导的ERS可通过调控UPR和自噬反应，促进自身复制。

3.1.2 丙型肝炎病毒(HCV) HCV的基因组编码2个包膜蛋白E1和E2，它们在内质网中成熟，形成非共价键结合的天然复合物和二硫键结合的聚集体。该病毒的非结构蛋白在核周区网状的ER膜上形成核糖核蛋白复合体，在病毒基因组复制和肝细胞建立感染过程中起关键性作用。这种病毒蛋白给内质网带来了巨大压力，诱导内质网应激，随后引起未折叠蛋白反应。HCV所诱导的UPR反应中，ATF6切割水平明显增高，诱导了UPR的标志性分子GRP78。在UPR另外一条道路PERK中，病毒抑制eIF-2α的磷酸化，阻断了该通路的翻译抑制，是病毒蛋白正常表达。HCV复制改变了UPR信号通路的典型特征，延长病毒存活时间，从而有利于病毒自身的增殖。

3.1.3 猪流行性腹泻病毒(PEDV) PEDV的结构蛋白S、M以及非结构蛋白ORF3，均可诱发内质网应激，并且诱导BIP升高。这些蛋白主要激活UPR信号通路中的PERK通路，使 PERK 和 eIF-2α 的磷酸化水平明显增加。病毒对ATF6的蛋白酶切割水平和IRE1通路中XBP-1转录编码的剪切作用却无明显影响。PEDV通过诱导内质网应激进一步刺激细胞自噬，从而导致细胞死亡。在感染PEDV的细胞中，使用特异性增强PERK信号通路激活的药物Salubrinal处理能够抑制病毒的复制，这也提示了内质网通过PERK途径抑制病毒感染。关于PEDV是否可抵抗UPR的抑制作用，还需更加深入研究。

3.2 DNA病毒

3.2.1 乙型肝炎病毒(HBV) HBV可通过表达病毒调节蛋白X(HBx)，诱导内质网应激，激活未折叠蛋白反应(UPR)的IRE1-XBP-1通路。现有研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原HBSAG是HBV诱导内质网应激的主要原因。XBP-1的靶基因EDEM与HBV的生命周期紧密相连，有趣的是，病毒并未抑制其靶基因的转录，而是刺激内质网相关降解(ERAD)途径，上调、等相关降解基因。进而减少包膜蛋白数量，减轻内质网压力，抑制因长时间内质网应激所带来的细胞凋亡，从而促进病毒增殖，建立持续感染。在感染HBV小鼠中发现了磨玻璃肝细胞(GGH)现象。GGH的形成是由于内质网中表面抗原过多而导致细胞质均匀暗淡，最终呈现玻璃样外观。慢性HBV与肝癌细胞紧密相关，而GGH被证实是肝细胞癌的标志物，这些线索可能暗示由乙型肝炎病毒所诱发的肝癌细胞与内质网应激有某种内在联系。

3.2.2 人巨细胞病毒(HCMV) HCMV诱发ERS，可调控3条UPR反应通路从而利于自身复制。HCMV诱导PERK和eIF-2α的磷酸化，有研究表明，在HCMV感染的细胞中，磷酸化的eIF-2α并未造成翻译抑制。在ATF6通路中，HCMV会诱导ATF6糖基化，并转位至高尔基体中，却抑制其在高尔基体中的剪切，也就抑制了ATF6的转录活性，导致下游的BIP或GRP94的表达受阻。在IRE1通路中，HCMV感染刺激了XBP-1mRNA的剪接，然而在HCMV感染的细胞中未检测到XBP-1靶基因EDEM。EDEM等蛋白的表达能够抑制病毒复制，病毒通过抑制这类蛋白，触发UPR反应，从而创造利于自身复制的条件。在HCMV感染过程中，病毒的US12家族基因可编码1种离子通道的病毒蛋白US12，减少Ca在细胞内质网中的堆积，缓解内质网应激，使细胞免于持续的内质网应激而凋亡，从而促进细胞存活，延长病毒复制时间。总之，在HCMV感染期间，UPR被诱导，但以有利于病毒感染的方式进行修饰，抑制不利于病毒复制的作用，维持有利的作用。

3.2.3 伪狂犬病病毒(PRV) 在PRV感染的早期阶段，BIP的表达增加，诱导了内质网应激。PK-15细胞在感染早期，BIP被上调，强化内质网中的蛋白质折叠功能，有利于病毒感染。随后BIP表达被抑制，以免严重的内质网应激，而导致细胞凋亡，阻碍病毒的持续感染。对UPR 3个分支的检测表明，IRE1-XBP-1通路在PRV感染过程中被激活，但抑制该通路的表达对病毒复制并无显著影响，内在的复杂机制还未得到很好解释。

3.2.4 猪圆环病毒2型(PCV2) PCV2 ORF5蛋白定位于内质网，会诱发内质网腔发生扩张和肿胀，上调应激标志分子BIP和GRP94的蛋白水平，从而诱导内质网应激。现有研究表明，PCV2激活PERK途径，并且选择性激活通路的下游因子，在用丹参素抑制了 eIF-2α 去磷酸化后，PCV2的复制也明显被抑制。因此，PCV2可能通过eIF-2α的去磷酸化恢复细胞翻译水平，加强病毒蛋白表达，有利于自身复制。牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)本身可通过强化蛋白质折叠而缓解内质网应激，在使用TUDCA处理细胞后，PCV2的复制得到明显加强。TUDCA配合PCV2衣壳蛋白的折叠装配，与其本身的抗凋亡作用，也为PCV2的感染提供有利场所。

4 内质网应激与病毒感染导致的代谢综合征

在细胞的生理活动中，内质网不仅作为蛋白质的折叠加工及分泌场所，在脂肪和葡萄糖代谢中也起着关键作用，许多代谢通道的传感、信号机制存在于内质网膜上或结构域中。如负责调控脂质代谢的关键因子SREBPs，在正常状态下附着在内质网膜上，当机体脂质水平较低时，便会移位至高尔基体，并被蛋白酶水解切割活化，转移至细胞核内调控脂质基因，内质网通过这种途径启动胆固醇合成。通过这种途径，内质网应激与多种病毒性肝炎密切关联。在各种肝脏病毒所诱导的慢性内质网应激中，也会诱发脂质代谢的紊乱。

并且现在越来越多的证据表明，内质网应激与糖尿病、动脉粥样硬化也均有意想不到的联系。正常状态下，激活的胰岛素受体磷酸化酪氨酸残基上的近端信号分子，也称胰岛素受体底物(IRS-1)，与胞浆靶标相互作用发挥胰岛素功能。在肥胖、遗传、饮食不当等情况下，这种磷酸化被JNK关联的IRS-1丝氨酸磷酸化通路抑制，而与肥胖相关的JNK激活机制与内质网应激有关。内质网应激通过IRE1通路，直接触发JNK级联反应。通过激活JNK家族，内质网参与了脂毒作用途径，进而诱导代谢综合征，其特征就是葡萄糖耐受和胰岛素抵抗。

在研究肝炎病毒或其他一些诱发生命体代谢紊乱的相关病毒及代谢综合征中，内质网的系列途径也是未来非常重要的探究方向。

5 总结

细胞产生的内质网应激属于细胞自身适应环境的机制，以不同的通路选择解决各种因外部环境所造成的内质网压力，其目的是为了让细胞存活的概率提高。当这种应激状态进一步破坏生物体整体生存利益时，细胞将会采用自噬或者凋亡的手段，维持生物体的稳态。

当病毒侵入宿主细胞，大量的病毒蛋白翻译合成，在内质网中堆积，或造成内质网Ca失衡时，均会造成内质网应激，不同病毒在面对内质网应激时的拮抗反应不同。一方面，有些病毒可控制内质网应激反应，诱导UPR从而利于病毒蛋白折叠和病毒复制，或者通过自噬使病毒能够对机体造成持续感染。另一方面，UPR的结果，如减弱翻译、ERAD和细胞凋亡，均限制病毒复制。在对抗UPR反应的过程中，不同的病毒有着不同的策略。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)触发PERK的激活并介导 eIF-2α-p 去磷酸化，HSV-1的糖蛋白B(gB)通过与PERK相关来调节病毒蛋白的积累，以维持内质网稳态。HSV-1被发现能在病毒感染的早期有效解除UPR武装，并在HSV-1复制的最后阶段激活eIF2α-ATF4信号通路。然而，蜱传脑炎病毒(TBEV)触发了UPR的IRE1途径和ATF6，IRE1抑制剂(3，5-二溴水杨醛)显著限制了TBEV在Vero E6细胞中的复制。

对内质网应激的研究不仅是理解病毒对细胞感染的复杂机制，也是在目前对抗病毒、利用病毒的重要手段。在上述中的TBEV中，采用UPR抑制剂便可作为全新的治疗策略来对抗病毒感染。在HIV蛋白酶抑制剂的研究过程中，药物本身虽然可提高艾滋病患者的生存质量，也可造成脂质失调和动脉硬化，其关键原因便是药物本身对内质网应激的激活。

深入研究内质网应激及随后的UPR与细胞自噬、凋亡、代谢过程密切结合，能够更加深入透彻地研究病毒，也为研究病毒和一些复杂的生理特征提供了全新的方向。在对抗病毒的过程中，UPR反应中的各个因子也可能是抑制病毒复制的有效靶点，针对这些靶点开发新的药物或疫苗对减少病毒对人体或动物的侵害具有重大意义。