外源大麻二酚对Cd 和Cr 胁迫下烟草种子萌发的影响*
2022-09-22杨嘉玲邹红旭翁玉仙樊兴荣王丽华保志娟
管 娇,杨嘉玲,邹红旭,翁玉仙,樊兴荣,王丽华,保志娟
(云南农业大学 烟草学院,云南 昆明 650201)
重金属胁迫是限制植物生长发育的不良条件之一。一般来说,种子萌发和幼苗生长是植物生长过程中的关键阶段,由于一些防御机制还没有完全形成,对重金属更为敏感。已有研究表明:重金属胁迫会抑制植物的种子萌发和幼苗生长[1-2]。烟草是中国重要的经济作物,极易吸收和富集Cd、Pb 和Cr 等重金属,Cd 和Cr 胁迫下烟草种子发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、苗高和叶绿素含量均下降,根冠比变小,生长受到抑制[3-4]。因此,研究缓解重金属对种子萌发的影响势在必行。
添加外源物是缓解植物重金属污染的有效手段之一。常用的外源物有矿质元素(如K、Ca 和Zn)[5]、植物激素(如水杨酸和脱落酸)[6]以及气体信号分子(如NO 和H2S)[7-8]等。由于自身的抗氧化性及其对金属离子的强螯合和细胞膜稳定作用[9],酚类物质也被应用于缓解逆境胁迫。早期研究表明:合生花根系多酚在缓解铅毒害中发挥了重要作用[10]。近年来,有学者添加外源茶多酚以缓解植物重金属胁迫和盐胁迫[11],还有学者添加麝香草酚提高植物的耐盐性[12],这些研究表明酚类物质主要是通过提高植株抗氧化活性和清除活性氧以抵御逆境胁迫,但其机制还有待深入探讨。
大麻(Cannabis sativaL.)是中国传统经济作物之一,是一种高生物量、生长快、具有多用途和多功能的物种[13]。由于对重金属的耐受性较高,工业大麻已成为修复土壤重金属污染的植物之一[14]。大麻二酚(cannabidiol,CBD)是工业大麻花和叶器官内特有的次生代谢产物,具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤和神经保护等多种生物活性,已成为医疗和化妆品领域的研究热点[15-16]。同其他酚类物质一样,CBD 在机体内能够通过多种方式应对氧化应激损伤,保护神经细胞[17],如上调金属硫蛋白2 (Mt2)、调节细胞内锌离子浓度或利用本身具有的强还原性直接清除活性氧(ROS)等[18]。目前,CBD 对植物生长发育和重金属抗性影响的研究还鲜见报道,本研究以K326 和白肋烟鄂烟1 号为试验材料,探讨外源CBD 施用对Cd 和Cr 胁迫下烟草种子萌发和幼苗素质的影响,以期拓展CBD 在农业中的应用,为植物重金属污染防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草品种为K326 和白肋烟鄂烟1 号,种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。选取饱满的烟草裸种,在试验前用20% NaClO 浸泡消毒10 min,蒸馏水反复冲洗5~10 遍,播种前用滤纸吸干种子表面的水分。
1.2 试验方法
试验于2021 年3—4 月在智能光照培养箱(GXZ 型,宁波东南仪器公司)中进行,通过预试验确定抑制烟草种子的Cr6+、Cd2+和CBD 质量浓度范围,Cr6+胁迫质量浓度设置为8 mg/L,Cd2+胁迫质量浓度设置为30 mg/L,CBD 质量浓度设置为0、1、5 和25 mg/L。CBD 对烟草种子和幼苗的影响设计为单因素试验,各烟草品种共4 组处理;CBD 对重金属胁迫烟草种子和幼苗的缓解作用设计为双因素试验,各重金属胁迫下各烟草品种共4 组处理。
将已消毒的种子均匀放入直径为10 cm 的培养皿中,内铺2 层无菌滤纸,滤纸用4 mL 相应处理液润湿,每皿播种50 粒。处理液为相应质量浓度的金属离子与CBD 溶液的混合液,现配现用,配制方法为:Cr6+和Cd2+分别用重铬酸钾(K2Cr2O7,分析纯) 和二水乙酸镉[(CH3COO)2Cd·2H2O,分析纯)]配制为高质量浓度溶液,之后取一定量用CBD 溶液稀释至所需质量浓度;CBD溶液用含0.1%的二甲基亚砜和0.07%的吐温-80混合溶液溶解CBD 粉末(纯度99%,购自云南汉盟制药有限公司)而成。以无CBD 处理为对照组(CK),每个处理重复3 次。种子置于培养箱中培养(温度26 ℃、光照12 h/黑暗12 h、光照强度3 000 lx),每天添加0.5 mL 相应处理液以保持滤纸湿润,培养至一定时间后备用。
1.3 测定项目与方法
以种皮裂开、胚根露出为种子萌发的标准,培养期间每天记录种子萌发的数量,培养3 d 后统计种子的发芽势;7 d 后每个培养皿随机选取10 株幼苗用直尺测定根长和苗高,并统计烟草种子的发芽率;14 d 时统计死亡幼苗株数,之后每个培养皿取35 株测定幼苗的干质量(105 ℃杀青,60 ℃烘干至恒质量)。各指标的计算方法为:
发芽势(GE)=3 d 内发芽种子粒数/供试种子数×100%;
发芽率(GR)=7 d 内发芽种子粒数/供试种子数×100%;
发芽指数(GI)=∑Gt/Dt;
活力指数=发芽指数×苗高;
幼芽毒害死亡率=14 d 时所有死亡的幼芽数/供试种子数×100%。
式中:Gt为第t天的发芽种子数,Dt为发芽时间。
1.4 数据处理
试验数据采用 Origin 2018 和 SPSS 25 软件进行统计分析及差异显著性检验。对不同处理的数据进行单因素方差分析(ANOVA)和 Duncan 多重比较,显著性水平设为0.05。数据以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 正常条件下施用CBD 对烟草种子萌发和幼苗生长的影响
2.1.1 对烟草种子萌发的影响
由表1 可知:正常条件下,除对照组外,2 种烟草种子的萌发均随CBD 质量浓度的增加而增加。25 mg/L CBD 处理时,K326 和鄂烟1 号种子的活力指数最高,分别比对照显著提高11.59%和47.32%;施用CBD 后,K326 种子的发芽势、发芽率和发芽指数均低于对照,其中1 mg/L CBD 处理的各指标分别较对照显著降低5.04%、2.78%和5.69%;而CBD 对鄂烟1 号的影响却与之相反,高质量浓度CBD 处理与对照差异显著,其中发芽指数比对照显著增加17.48%。
表1 大麻二酚(CBD)对烟草种子萌发指标的影响Tab.1 Effects of cannabidiol (CBD) on the germination of tobacco seed
2.1.2 对烟草幼苗生长的影响
由图1 可知:正常条件下,施用CBD 对K326和鄂烟1 号幼苗的生长均有一定促进作用,但最佳的CBD 质量浓度不一致。对K326 幼苗而言,5 mg/L CBD 处理的根长和干质量最高,分别比对照显著提高8.96%和26.17%;而25 mg/L CBD处理的芽长最长,较对照显著增加14.85%。对鄂烟1 号而言,促幼苗生长效果最好的CBD 质量浓度为25 mg/L,幼苗的根长、芽长和干质量分别较对照显著提高14.00%、25.00%和33.96%。
图1 大麻二酚(CBD)对烟草幼苗生长相关指标的影响Fig.1 Effects of cannabidiol (CBD) on the growth of tobacco seedlings
2.2 施用CBD 对Cr 和Cd 胁迫下烟草种子萌发和幼苗生长的影响
2.2.1 对受胁迫烟草种子萌发的影响
结合表1 和表2 可知:在Cr、Cd 胁迫下,2 种烟草种子的萌发受到抑制,各指标均降低,其中鄂烟1 号下降较为明显。施用CBD 对Cr、Cd 胁迫下烟草种子萌发指标均有促进作用,且除Cr 胁迫鄂烟1 号种子萌发指标随CBD 质量浓度增加而上升外,其他处理各指标均随CBD 质量浓度增加呈先上升后下降的趋势。当CBD 质量浓度为5 mg/L 时,烟草种子活力指数比单独Cr 处理显著提高49.18% (K326)和30.87% (鄂烟1 号),烟草种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数分别比单独Cd 处理显著提高7.56%、4.38%、8.11%、35.58% (K326)和19.52%、4.65%、25.81%、51.50% (鄂烟1 号)。
表2 大麻二酚(CBD)对Cr 和Cd 胁迫下烟草种子萌发的影响Tab.2 Effects of cannabidiol (CBD) on the germination of tobacco seeds under Cr and Cd stress
2.2.2 对受胁迫烟草幼苗生长的影响
由图2 和图3 可知:在Cr、Cd 胁迫下,施用CBD 对2 个品种的烟草幼苗生长均有促进作用,且对幼苗生长的影响及最佳质量浓度同种子萌发指标变化一致。Cr 胁迫下,随着CBD 的质量浓度的增加对K326 幼苗的生长呈先促进后抑制的作用,5 mg/L CBD 处理的K326 幼苗根长、芽长和干质量最高,分别比Cr 处理提高96.88%、31.98%和22.72%;鄂烟1 号幼苗的根长、芽长和干质量在25 mg/L CBD 时最高,分别比Cr 处理显著提高223.53%、30.00%和24.39%。Cd胁迫下,K326 和鄂烟1 号幼苗生长指标均随CBD质量浓度增加呈先增后降的趋势,均在5 mg/L CBD 处理下达到最大值,其中,K326 幼苗的根长和干质量分别比对照显著提高110.53%和79.24%,鄂烟1 号幼苗的根长和干质量分别比对照显著提高157.14% 和82.15%。
图2 大麻二酚(CBD)对Cr 胁迫下烟草幼苗生长的影响Fig.2 Effect of cannabidiol (CBD) on the growth of tobacco seedlings under Cr stress
图3 大麻二酚(CBD)对Cd 胁迫下烟草幼苗生长的影响Fig.3 Effect of cannabidiol (CBD) on the growth of tobacco seedlings under Cd stress
2.3 施用CBD 对Cr 和Cd 胁迫下烟草幼苗死亡率的影响
由图4 可知:各质量浓度CBD 均可显著缓解Cd 和Cr 对烟草幼芽的毒害。Cr 胁迫下,随着CBD 质量浓度的增加,K326 幼苗死亡率先下降后上升,鄂烟1 号幼苗死亡率则逐步下降,5 和25 mg/L CBD 处理时K326和鄂烟1 号幼苗死亡率分别达到最低值,分别比单独Cr 处理显著降低67.73%和76.04%;Cd 胁迫下,K326 和鄂烟1 号幼苗的死亡率均随CBD质量浓度的增加而先降低后升高,缓解效果最佳的是5 mg/L CBD 处理,K326 和鄂烟1 号幼苗的死亡率分别比单独Cd 处理显著降低69.5%和47.05%。
图4 大麻二酚(CBD)对Cr (a)和Cd (b)胁迫下烟草幼苗死亡率的影响Fig.4 Effect of cannabidiol (CBD) on the mortality of tobacco seedlings under Cr (a) and Cd (b) stress
3 讨论
种子萌发是植物生命进程的开始,也是植物生长和繁衍的重要途径。本研究中,在无重金属胁迫下,CBD 对K326 种子的萌发有轻微的抑制作用,但却促进了鄂烟1 号种子萌发。CBD 对2 种烟草种子萌发作用的差异,表明它对种子萌发的影响可能与种子及其幼苗内部同工酶、激素(细胞分裂素和生长素等)的种类及水平等自身特性有关[19]。低质量浓度的CBD 可干扰K326 种子内部物质的代谢,抑制细胞分裂、伸长及膜渗透性等,阻碍种子萌发,因此表现出低质量浓度对种子萌发具有抑制的作用;而随着CBD 质量浓度增加,其抗氧化活性增加,对种子的抑制作用下降。可能受种子成熟度的影响,本研究中鄂烟1 号种子出苗的整齐度和一致性较差,而CBD 的施入可打破种子休眠,加速种子萌发,提高出苗整齐度[20],因此,随CBD 质量浓度的增加,其对鄂烟1 号的促进作用增强。此外,不同烟草种子表面结构不同,CBD 在2 种不同种子表面的渗透能力差异也可能导致不同的变化规律。
重金属胁迫会诱导植株体内生成过量ROS,破坏种子及幼苗的抗氧化平衡,从而产生毒害[21]。目前普遍认为 CBD 的活性作用主要与其自由基清除及抑制炎症因子释放有关[22]。本研究发现:施用CBD 可以有效缓解Cd、Cr 胁迫对K326 和鄂烟1 号种子萌发及幼苗生长的损伤,可能是因为CBD 能清除重金属导致的过量ROS,提高烟草种子及幼苗的抗氧化能力[23]。同时CBD 结构中的酚羟基络合了部分金属离子,使重金属的生物活性降低从而缓解重金属对烟草幼苗的毒害。对同一烟草品种而言,CBD 对Cd 胁迫的缓解效果优于Cr,这可能是不同金属元素与CBD 的交互作用不同,且与工业大麻对Cd 的高富集性有一定的关系[13]。此外,在相同重金属胁迫下,CBD 缓解2 种烟草种子萌发的最佳质量浓度有差异,可能一是不同烟草类型和品种对重金属的耐性不同[24],二是不同基因型对所处环境的敏感程度不同,从而导致2 种烟草种子对CBD的响应不同。
根部是烟苗吸收Cr 和Cd 等重金属离子的主要器官,故也是受重金属胁迫最严重的部位[25]。本研究发现:正常培养和重金属胁迫下,均表现出CBD 对2 个品种烟草种子活力指数和幼苗根的促进作用较为明显,这与王一峰等[26]的结论一致。这是因为种子在发芽过程中,胚根快速吸水伸长并最先突破种皮,使得根受重金属胁迫以及接触CBD 溶液在时间进程上大于和早于芽,因此根的变化比其他器官显著;也可能是因为同一植物的不同组织或部位对CBD 的敏感程度有差异。种子活力即种子的健壮度,是种子的发芽率和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力以及生产潜力的总和,是种子品质的重要指标。施用CBD 使烟草种子的活力指数显著提高,说明CBD 可以提高烟草种子的综合素质,但其机理还有待进一步探讨。CBD 可以缓解重金属胁迫对烟草种子及幼苗的毒害,但CBD 对不同植物、不同器官及在不同质量浓度和不同重金属胁迫下产生的作用也不同,在实际生产中应根据品种和不同胁迫选择适宜的CBD 质量浓度。
4 结论
(1) 正常条件施用CBD 可抑制K326 种子萌发,但可促进其幼苗生长发育;随质量浓度增加,CBD 对白肋烟鄂烟1 号种子萌发和幼苗生长的促进作用增强。
(2) 施用CBD 可有效缓解Cd 和Cr 胁迫对K326 和鄂烟1 号的毒害作用。CBD 在抗重金属胁迫方面具有潜在的应用前景。