银菊止痒洗液HPLC特征指纹图谱及聚类分析

谢 巍，杨 妮，肖 萍，卢森华，莫礼艳

（1.柳州市妇幼保健院/广西科技大学附属妇产医院儿童医院，广西 柳州 545001；2.玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林 537000）

银菊止痒洗液由金银花、野菊花、蛇床子、苦参等7味中药组成，是柳州市妇幼保健院多年来在临床用药经验和辩证施治原则的基础上总结的有效方剂。其中，野菊花具有疏散风热、清肝明目、解毒的功效，金银花具有宣散风热、清解血毒的功效，蛇床子具有燥湿、祛风、杀虫的功效［1］，诸药合用具有清热燥湿、解毒止痒的疗效，可广泛应用于小儿腠理失和、湿热内蕴所致的湿疹。该方剂中的主要化学成分有绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素等［2-4］，据相关文献报道，绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素具有较强的抗细菌、炎症、真菌、心肌纤维化、病毒等作用［5-8］，提示其可能为银菊止痒洗液的活性成分。

国内外有许多学者对上述化学成分进行了含量测定研究［9-12］，这些研究对银菊止痒洗液的质量控制有很好的指导意义，但中药制剂组成复杂多变，仅仅依靠含量测定难以全面评价中药制剂质量。而指纹图谱却能突出中药制剂的完整面貌，并且同类制剂的指纹图谱具有相似性，依靠图谱可以实现对中药制剂内在化学成分的综合评价以及整体质量的全面控制，使中药制剂的成分更加可控［13］。系统聚类分析能通过数学处理方法替代传统靠经验和专业知识来进行分类工作［14］。为全面控制银菊止痒洗液质量，本研究拟通过HPLC特征指纹图谱法结合系统聚类分析的方法对不同批次银菊止痒洗液展开研究，为银菊止痒洗液的质量控制提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

U3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；HH-S6型恒温数显水浴箱（金坛市医疗仪器厂）；KQ-500GDV型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Synergy型超纯水机（美国默克公司）；FW80型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；XS-205Du型电子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）。

1.2 药品与试剂

银菊止痒洗液源于柳州市妇幼保健院；绿原酸（纯度99.3%）、蒙花苷（纯度95.1%）、咖啡酸（纯度96.2%）、蛇床子素（纯度98.2%），中国食品药品检定研究院；正丁醇（AR），东莞市今胜化工有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），德国默克公司；去离子水，Synergy超纯水机制作。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 采用CAPCELL PAK C18MGⅡ色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表1。检测波长330 nm，柱温25℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.2 溶液制备

1）溶液制备。精密称取绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素对照品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解，定容至刻度，得到单一对照溶液。分别精密量取单一对照品溶液各1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，即得混合对照品溶液。

2）供试品溶液制备。精密量取银菊止痒洗液20.0 mL置于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次25 mL，合并正丁醇层，再用正丁醇饱和的水萃取2次，每次25 mL，弃去水洗液，合并正丁醇层，水浴蒸干，用甲醇溶解，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.3.3 精密度试验 精密量取银菊止痒洗液20 mL，按照“1.3.2”方法制备供试品溶液，依“1.3.1”色谱条件，连续进样6次，记录图谱及峰面积，以A15为参照峰，分别计算银菊止痒洗液中共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD。

1.3.4 重复性试验 分别精密量取同一批次银菊止痒洗液样品6份，每份20 mL，按照“1.3.2”方法制备供试品溶液，依“1.3.1”色谱条件进样分析，记录图谱及峰面积，以A15为参照峰，计算银菊止痒洗液中共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD。

1.3.5 稳定性试验 精密量取银菊止痒洗液样品20 mL，按照“1.3.2”方法制备供试品溶液，依“1.3.1”色谱条件分别于1、2、4、6、8、12 h，连续进样6次，记录图谱及峰面积，以A15为参照峰，计算银菊止痒洗液中共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2 结果与分析

2.1 精密度试验

精密度试验结果表明，银菊止痒洗液样品中15个共有峰的相对保留时间的RSD为0.04%～0.40%，相对峰面积的RSD为0.05%～1.50%，表明仪器的精密度良好。

2.2 重复性试验

重复性试验结果表明，共有峰的相对保留时间的RSD为0.04%～0.60%，相 对 峰 面 积 的RSD为0.50%～1.80%，表明该试验方法重复性良好。

2.3 稳定性试验

稳定性试验结果显示，相对保留时间RSD为0.04%～0.50%，相对峰面积RSD为0.07%～2.00%，说明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 HPLC特征指纹图谱的建立

2.4.1 不同批次银菊止痒洗液的指纹图谱采集 分别精密量取银菊止痒洗液20 mL，按照“1.3.2”方法制备供试品溶液，依“1.3.1”色谱条件进样分析，记录12批银菊止痒洗液样品的HPLC色谱图谱、保留时间和峰面积。将12批银菊止痒洗液样品的图谱及数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”［15］，建立银菊止痒洗液叠加HPLC色谱（图1）。共获得15个共有峰（编号为A1～A15），以蛇床子素色谱峰（15号峰）为参照峰，指认了14个共有峰。对照色谱、共有模式指纹图谱、HPLC叠加色谱分别见图1、图2、图3。

图1 混合对照品色谱

图2 银菊止痒洗液对照指纹图谱

图3 12批银菊止痒洗液HPLC叠加色谱

2.4.2 共有峰和指纹图谱确定 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版（2004）》软件对HPLC数据进行处理。自动匹配指纹图谱数据的相关参数，标定银菊止痒洗液共有峰，并生成对照指纹图谱。本研究共标定了15个共有峰，参照图谱选择样品，时间窗宽度设定为0.1 min，多点校正并自动匹配谱峰，采用中位数法生成对照指纹图谱。把参照峰A15的峰面积看作1，分别计算不同批次银菊止痒洗液共有峰的相对保留时间和峰面积，并根据指纹图谱共有模式计算相似度（表2）。结果显示，相对峰面积的RSD为6.40%～35.50%，相对保留时间的RSD为0.03～0.40%，相似度在0.963～0.999。

表2 银菊止痒洗液HPLC特征指纹图谱相似度评价结果

2.5 系统聚类分析

采用SPSS 19.0软件进行系统聚类分析，以12批不同批次银菊止痒洗液序号为横向列，以15个共有特征峰为纵向列，以各自对应相对峰面积为指标，组成12×15原始数据表，先将数据进行Z得分标准化处理，再以平方Euclidean距离为度量标准，采用组间对比和距离公式作为样品的测度进行系统聚类分析（图4）。结果表明，当距离标尺为5时，12批银菊止痒洗液样品被分为4类，其中S3、S7和S12聚为第一类，S1、S5、S8、S10、S2和S11归为第二类，S4和S6聚为第三类，S9单独归为第四类；当距离标尺为10时，12批银菊止痒洗液样品被分为3类，其中，S4和S6归为第一类，S1、S2、S5、S8、S10和S11聚为第二类，S3、S7、S9和S12聚为第三类；当距离标尺为25时，样品被分为2类，S4和S6归为一类；其他归为一类。

图4 银菊止痒洗液样品聚类分析

2.6 主成分分析

利用SPSS 19.0软件，以银菊止痒洗液的15个共有峰的峰面积为指标，对共有峰面积进行标准化处理后再进行主成分分析，分别得到主成分特征值、方差贡献率和累计方差贡献率。结果2个主成分的特征值为10.170和3.158，均大于1，方差贡献率分别为67.797%和21.055%，2个主成分累积方差贡献率为88.852%。表明这2个成分是影响银菊止痒洗液的主要因子，基本反映出银菊止痒洗液的质量评价指标，故选择提取前2个主成分进行分析。

将得到的2个因子的成分矩阵进行正交旋转处理，得到主成分因子1大于0.9的有1号峰（0.937）、2号峰（0.968）、4号峰（0.961）、5号峰（0.952）、7号峰（0.960）。 主 成 分 因 子2大 于0.9的 有 ：10号 峰（0.925）、11号峰（0.948）。其中因子1的2号峰（绿原酸）和因子2的11号峰（蒙花苷）对主成分贡献最大，根据旋转成分矩阵可推测绿原酸、蒙花苷对银菊止痒洗液制剂品质有明显的影响，可作为银菊止痒洗液质量评价指标。

将上述2个因子分别乘以对应的标准化处理后峰面积，分别得到因子1（F1）、因子2（F2）得分，再分别乘以各自方差贡献率除以累积方差贡献率，即可得到不同批次银菊止痒洗液的综合得分（F），制剂的整体质量越好综合得分越高。综合得分最高的前3名样品为S6、S9和S4，当综合得分大于10.989时S6、S9、S4聚为一类。当综合得分小于于10.989时S10、S2、S12、S1、S7、S5及S3归为一类，与聚类分析中距离标尺为25时分类基本一致，具体结果见表3。

表3 12批银菊止痒洗液制主成分得分、综合得分及排名

3 小结

前期的研究建立了银菊止痒洗液中4个化学成分含量测定方法［16］，为全面控制银菊止痒洗液质量，本研究结合含量测定方法和色谱条件，建立了12批银菊止痒洗液指纹HPLC图谱分析方法。根据色谱图的峰分离效果以及峰面积标定了15个共有峰，并指认了其中4个共有峰，进一步结合相似度评价，计算了不同批次银菊止痒洗液的质量。结果表明，本研究所建立的HPLC指纹图谱法准确、稳定、重现性好、专属性强，有效地补充了含量差异的不足。同时，也存在着不足之处，指纹图谱采用含量测定色谱条件，各色谱峰相对集中，要达到很好的分离效果，对色谱柱提出了较高的要求。

聚类分析结果显示，当距离标尺为5时，12批银菊止痒洗液样品被分为4类，其中S3、S7和S12聚为第一类，S1、S5、S8、S10、S2和S11归为第二类，S4和S6聚为第三类，S9为第四类。提示在生产过程中，投料时应注意药材产地、厂家和批次的选择。主成分分析中S6、S9、S4综合评分较高，结合主成分分析结果，提示道地药材在中药制剂生产中应优先选择。

银菊止痒洗液对照指纹图谱中蛇床子素（15号峰），具有峰面积较大、保留时间适中的特点，且为样品共有已知成分，故选用15号峰作为参照峰。