荧光量子效率绝对法测量系统校准及不确定度评定

贾志立,卜天佳,姚雅萱,任玲玲

(中国计量科学研究院 前沿计量科学中心,北京100029)

1 引 言

荧光材料被广泛应用于照明、显示、光通讯、光存储以及生物医学成像等领域。荧光材料在光的激发下,电子由导带被泵浦到价带,留下空穴,之后电子再跃迁回导带并与空穴复合发射出光子。荧光量子效率是荧光材料发射的光子数与吸收的光子数之比[1,2],反映了荧光材料的发光性能,是评价荧光材料非常关键的指标之一,直接影响显示产品的能量转换效率、荧光标记的检测灵敏度以及化工领域荧光产品的质量提升[3～6]。因此,准确测量荧光量子效率对于表征荧光材料的发光性能是非常重要的。

测量荧光量子效率的方法包括相对法和绝对法[7]。相对法是采用已知荧光量子效率的标准物质作为参比物,测量参比物和待测样品的发射光波段光谱积分面积在激发波长处的吸光度以及所用溶剂的折射率,通过计算得到待测样品的荧光量子效率[8,9]。绝对法是测量待测样品的激发光波段和发射光波段的光谱,通过对光谱积分,从而得到待测样品吸收的光子数和发射的光子数,计算发射的光子数与吸收的光子数之比,直接得到其荧光量子效率[10～15]。绝对法测量直接测量荧光材料的荧光量子效率不需要参比物,因此准确可靠的绝对测量方法也是量子效率标准物质的定值方法。

荧光量子效率绝对法测量系统由光源、单色仪、积分球、光纤及探测器组成。为了确保该绝对测量方法的准确可靠,要将测量过程中影响测量结果的不确定因素排除或量化以进行校准。在测量过程中,光源通过单色仪进行分光,从而获得一定波长的单色光做激发光,所以不需要对整个光源的光谱进行校准,只需对激发单元的单色仪进行波长校准；发射单元的单色仪同样需要校准,确保光谱采集波长的准确性。荧光材料在积分球中产生辐射,因自吸收会影响光谱的分布,需要对积分球进行校准[16]。光纤在测量系统中用来各器件链接,但是光在光纤的传输过程中光谱会发生改变,因此也需要进行校准[17]。此外,探测器在不同波长下的量子效率不同,即对不同波长光的响应不同,也是影响测量结果的因素之一。这些不确定因素的存在,会造成测量光谱的不准确,而荧光量子效率是通过对激发光波段和发射光波段的光谱积分得到光子数进行计算的,所以会进一步造成荧光量子效率计算结果的不准确。因此,建立合适的校准方法是荧光量子效率量值准确的重要保证。

本文采用溯源至国家辐射照度基准的汞氩灯对激发和发射单元的单色仪进行校准,采用同样溯源至国家辐射照度基准的标准辐射源对光路和探测器进行光谱相对强度校准,以保证整个系统测量中波长和光谱相对强度的准确性。从测量模型出发,对测量不确定度进行了分析[18，19]。从而建立一套合适的荧光量子效率绝对法测量系统校准和不确定度评定的方法。

2 测量原理

荧光量子效率测量系统主要包括3部分,即激发单元(氙灯和单色仪)、积分球、发射单元(单色仪和探测器),测量系统示意图如图1所示。

图1 荧光量子效率测量系统示意图Fig.1 Schematic diagram of fluorescence quantum efficiency measuring system

工作原理为：通过激发单元的单色仪,将氙灯光源分离出实验所需的激发光波长,激发光经过光纤入射到积分球中的样品上,样品经过激发后发射荧光,激发光和样品的荧光经过积分球均匀化后,由光纤输出到发射单元的单色仪分光,通过光电倍增管(photomultiplier tubes,PMT)采集,获得每个波长下的光子数,从而进一步分别获得激发光波段和发射光波段的光谱曲线,见图2。通过对激发光波段和发射光波段进行积分,分别计算发射到自由空间中的光子数与吸收的光子数之比,即荧光量子效率。

图2 硫酸奎宁溶液(QS)和空白样品(Blank)的激发光波段和发射光波段的光谱Fig.2 Excitation and emission spectra of quinine sulfate solution(QS) and Blank

荧光量子效率η测量模型及转换公式为：

(1)

在计算荧光量子效率的测量模型中，由于探测器探测的是光子数，因此可以把积分面积转换成在某一波长下(λabs和λem)光子数与光波段(λ2-λ1和λ4-λ3)的乘积，从而得到对应光波段的光子总数，并且光子数(或每秒光子数)正比于辐射照度与对应波长的乘积。

3 实验方法

荧光量子效率绝对法测量系统为HORIBA公司的产品,型号为Nanolog-Kit(FL3-2iHR)。

硫酸奎宁溶液(3.5 μg/mL,溶剂为0.05 mol/L H2SO4溶液)和空白样品(0.05 mol/L H2SO4溶液)光谱采集的实验条件为：选择1 200 g/mm的光栅,激发波长为350 nm,激发单元单色仪的狭缝为5 nm,发射单元单色仪的狭缝为3 nm,积分时间为0.1 s,采集波长范围为340～360 nm和360～750 nm,步长为0.5 nm。

标准汞氩灯(Ocean Optics,型号为HG-1)能提供一系列特征峰的谱线,用来校准单色仪的波长,标准汞氩灯的标准光谱由中国计量科学研究院光学所校准,波长的不确定度为0.1 nm(k=2)。首先采用标准汞氩灯对发射单元单色仪进行波长校准,再采用校准后的发射单元采集经激发单元单色仪分离出的激发光并进行校准,并溯源到国家光谱辐射照度基准。发射单元采集汞氩灯谱线的实验条件为：选择1 200 g/mm的光栅,发射单元单色仪的狭缝为0.02 nm,积分时间为0.1 s,采集波长范围为364.7～365.3 nm,步长为0.01 nm。对激发单元单色仪校准的实验条件为：选择1 200 g/mm的光栅,激发波长为350 nm,激发单元单色仪的狭缝为5 nm,发射单元单色仪的狭缝为3 nm,积分时间为0.1 s,采集波长范围为340～360 nm,步长为0.2 nm。

标准辐射源(氘灯(上海复享光学股份有限公司，型号为iDH2000-BSC)、带积分球的卤钨灯(广州景颐光电科技有限公司，型号为JYLS-B))能提供波长连续且稳定的光输出。标准辐射源的标准光谱由中国计量科学研究院光学所校准,其相对光谱辐射照度的扩展不确定度为5.6%(k=2,300 nm)。采用标准辐射源对光路、发射单元单色仪和探测器进行校准,并溯源到国家光谱辐射照度基准。测量标准辐射源光谱的实验条件为：打开标准辐射源,预热15 min,选择 1 200 g/mm的光栅,发射单元单色仪的狭缝设置为3 nm,积分时间为0.8 s,氘灯采集波长范围为300～400 nm，步长为2 nm，卤钨灯采集波长范围为300～900 nm,步长为10 nm。

4 结果与讨论

根据式(1)，测量结果的不确定性影响因素主要来源于光路(包括积分球、出射光纤和反射镜等)对光谱相对强度造成的改变,以及单色仪分光和探测器光谱响应度的校准。因此通过对光路、单色仪和探测器的校准,实现对整个测量系统波长和光谱相对强度的校准。

4.1 单色仪波长校准

汞氩灯具有一系列特征峰,采用标准汞氩灯对发射单元的单色仪进行校准,可保证光谱采集波长的准确性,再利用校准后的单色仪对激发单元的单色仪进行校准,从而保证激发光波长的准确性。

图3 单色仪波长校准Fig.3 Wavelength calibration of monochromators

实验中,将标准汞氩灯放置于发射单元单色仪的入口处,如图3(a)所示,将采集得到的谱线的特征峰位置与标准谱线的特征峰位置相比较,如果峰位置有偏差,则调整单色仪的光栅,将特征峰的量值调整为标准值,从而完成对发射单元单色仪波长的校准。由于汞氩灯特征峰(365.015 nm)可以在300～900 nm波长范围内进行校准,因此采用此特征峰对发射单元单色仪校准,图3(b)为发射单元单色仪校准后的365.02 nm波长处特征峰的谱线。对激发单元的单色仪的校准方法为：采用图1所示的光路,通过校准后发射单元的单色仪采集经过激发单元的单色仪分出的单色光,峰位的选择是根据样品的激发波长确定的,如设置激发光波长为350 nm；如果峰位置有偏差,则调整激发单元的单色仪光栅,将单色光的峰位调整为设置的350 nm,从而完成对激发单元单色仪的波长校准,图3(c)为激发单元的单色仪校准后波长为350 nm单色光的谱线。

对激发和发射单元单色仪的校准,保证了激发波长和发射波长的准确性,为下一步进行的光谱相对强度的校准打下基础。

4.2 光谱相对强度校准

由图1可以看到,积分球内的硫酸奎宁溶液被波长为350 nm的激发光激发发出荧光,激发光和荧光经过积分球、出射光纤、反射镜,到达发射单元单色仪和探测器而被采集，得到样品的激发光波段光谱Iex和发射光波段光谱Iem,见图2，因此需要对得到Iex和Iem光谱的测量系统进行校准。

校准前,积分球内不放置任何样品,校准是采用溯源到国家光谱辐射照度基准、光谱相对强度已知的标准辐射源,将氘灯和卤钨灯的标准光谱在350 nm处连接起来，根据式(1)中的换算，将相对光谱辐射照度值乘以对应波长得到纵坐标正比于每秒光子数(1/s)的标准光谱曲线为Ics,标准辐射源从积分球入口入射,如图4(a)所示,分别重复测量氘灯和卤钨灯的光谱3次取平均值，并在350 nm处连接起来，得到测量光谱曲线Im,如图4(b)所示。根据Cint=Ics/Im将图4(b)中的两条曲线相比较,得到光谱相对强度校准曲线Cint[18,19],见图4(c)。由校准曲线可以看出，在700～900 nm波段,特别是800～900 nm波段,曲线强度明显增加,由于系统采用的PMT探测器(HAMAMATSU,型号为R928P)在800～900 nm波段范围内,随着波长增加,探测器的量子效率明显降低,即光谱响应度明显降低,因此造成了校准曲线在这个波段内明显升高。

图4 光谱相对强度校准Fig.4 Calibration of spectral relative intensity

采用本文得到的校准曲线Cint(激发和发射波段的校准曲线分别是Cex和Cem)对图2得到的Iex和Iem校准时,将激发光和发射光波段的谱线乘以校准曲线，即可得到校准后的曲线Iexc和Iemc,即Iexc=IexCex和Iemc=IemCem。

4.3 不确定度评定

根据式(1)，输入量包括Eabs、Eem、λabs和λem，测量不确定度来源主要包括测量重复性引入的不确定度和标准器(标准汞氩灯和标准辐射源)引入的不确定度。

4.3.1 测量重复性引入的不确定度

重复测量标准辐射源的光谱10次,得到10次光谱如图5所示。

图5 标准辐射源的重复测量光谱Fig.5 Repeated measurement spectrum of standard radiation source

整个波段范围内的相对标准不确定度为：

(2)

由式(2)计算得到在激发光波段(如 300～360 nm)的最大相对标准不确定度为：

u1，rel(Eabs)=0.32%

由式(2)计算得到在发射光波段(如 370～900 nm)的最大相对标准不确定度为：

u1，rel(Eem)=0.19%

重复测量标准汞氩灯的365.02 nm特征峰10次，通过式(2)计算得到的相对标准不确定度可作为在激发光波段(如300～360 nm)和发射光波段(如370～900 nm)的相对标准不确定度：

u1，rel(λabs)=u1，rel(λem)=0.000 36%

由于测量模型中仅包含输入量的积和商，因此,测量重复性引入的相对标准不确定度为：

4.3.2 标准器引入的不确定度

标准辐射源校准证书中,在激发光波段(如300～360 nm)的最大相对扩展不确定度Urel(Eabs)为5.6%(k=2),则其相对标准不确定度为：

标准辐射源校准证书中,在发射光波段(如370～900 nm)的最大相对扩展不确定度Urel(Eem)为4.4%(k=2),则其相对标准不确定度为：

标准汞氩灯校准证书中的扩展不确定度Uλ为0.1 nm，包含因子k=2，在激发光波段(如300～360 nm)的最大相对标准不确定度为：

在发射光波段(如370～900 nm)的最大相对标准不确定度为：

由于测量模型中仅包含输入量的积和商,因此,标准器引入的相对标准不确定度为：

4.3.3 相对合成标准不确定度及扩展不确定度

相对合成标准不确定度为：

取包含因子k=2,则相对扩展不确定度为：

Urel(η)=kuc，rel(η)=7.16%

由以上分析可以得到,在300～360 nm的激发光波段和370～900 nm的发射光波段内,其相对合成标准不确定度为3.58%,相对扩展不确定度为7.16%,其他波段的不确定度可以采用同样的方法进行评定。

5 结 论

本文采用汞氩灯对系统中的发射单元的单色仪进行校准,再利用发射单元校准激发单元的单色仪,保证了激发波长和发射波长的准确性。采用标准辐射源对光路、发射单元单色仪和探测器进行光谱相对强度校准,保证了激发波段和发射波段光谱相对强度的准确性。最后从荧光量子效率的测量模型出发,分析不确定度分量,测量不确定度来源主要包括测量重复性引入的不确定度和标准器(标准汞氩灯和标准辐射源)引入的不确定度。最终获得的在300～360 nm的激发光波段和370～900 nm的发射光波段内相对合成标准不确定度为3.58%,相对扩展不确定度为7.16%,k=2。通过对荧光量子效率绝对法测量系统的波长和光谱相对强度进行校准,为荧光量子效率的准确测量提供参考。