高效液相色谱法测定平喘颗粒中柚皮苷的含量

马春琳

平喘颗粒是处方药，本制剂是蜜麻黄、杏仁、桔梗、枳壳、甘草、葶苈子、细辛、地龙、石膏等12味中药制成的颗粒剂，其中桔梗、枳壳粉碎成细粉入药。枳壳味苦、辛、酸，微寒。归脾、胃经。而善理气宽中，行滞消胀。古今用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂。平喘颗粒中枳壳为臣药，方中用量较大，其有效成分明确易于检测，经文献及药典检索，高效液相色谱法（HPLC）常作为中成药物组方中枳壳有效成分柚皮苷的质控标准[1-8]，因此依据药典方法对其质控成分柚皮苷进行HPLC测定研究。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，安捷伦1260）；分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司，AB104-S）；分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司，XS205DU）；纯水机（密理博，Blix 10）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯；柚皮苷（中国食品药品检定研究院，110722-201312）。

2 方法与结果

2.1 流动相考察

由于本品为蜜麻黄、杏仁、桔梗、枳壳、甘草、葶苈子、细辛、地龙、石膏等12味中药组成的复方医院制剂，流动相考察实验以方中臣药枳壳的质控成分柚皮苷为对象进行优化。参照药典对柚皮苷分离度、保留时间、对称因子、理论塔板数等进行考察。

2.1.1 供试品溶液的制备 称取本品约1 g，准确称量，放入带塞子的锥形瓶中，加入25 ml甲醇，盖上塞子，称重，超声处理30 min，冷却，用甲醇补充重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取适量柚皮苷对照品，加甲醇配成49.22 μg/ml溶液，即得。各溶液精密吸取10 μl，分别注入液相色谱仪，在283 nm处记录峰面积。其中序号1乙腈∶0.1%磷酸溶液=（0～20 min：18∶82；20～22 min：18～30∶82～70；22～32 min：30∶70）；序号2乙腈∶0.1%磷酸溶液=20∶80。综上实验结果，条件2出峰时间过短，分离度稍差，条件1的出峰时间适中，分离度较好，可满足检测需求，因此选择为流动相。见表1。

表1 流动相考察实验结果

2.2 专属性试验

精密吸取橙皮苷对照液、阴性对照液和重复性试验中的供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪测定[9]。结果表明，对照品和供试品在同一位置都有相应的色谱峰，保留时间一致。阴性对照色谱保留时间相同的位置没有相应色谱峰。结果表明其他药味对测试结果没有干扰。

2.3 耐用性试验

以建立的流动相为基础，稍微改变测定条件，对样品进行测定，计算其中含量。考察了变化色谱条件，包括检测波长和色谱柱对该方法的耐用性。结果：样品的相对标准偏差（RSD）分别为0.042和0.043，表明耐用性良好。见表2～3。

表2 不同波长考察

表3 不同色谱柱考察

2.4 重现性试验

以拟定的流动相为基础，在不同型号的液相色谱仪上进行样品测定，计算含量。以含量为依据，考察不同仪器对实验结果的影响，结果表明：RSD=3.0%，表明重现性良好。见表4。

2.5 线性关系的考察

精密吸取对照品储备液溶液1、2、5、8.35、10 ml用甲醇分别稀释至25 ml，得质量浓度为8.25、16.49、49.22、82.2、98.44的溶液，分别取10 ml注入液相色谱仪测定，记录峰面积[9]。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=9.229 1x-2.524 2，r=0.999 7。结果表明，柚皮苷溶液在0.082 5～0.984 4 mg样品量之间具有良好的线性关系。见表5、图1。

图1 柚皮苷标准曲线

表5 线性关系考察

2.6 仪器精密度测试

精密吸取10 μl 2.1.2的对照品溶液，按既定的色谱条件注入液相色谱仪[9]。重复操作6次，测定柚皮苷峰面积，RSD=0.004 0。测试结果表明，该仪器的精密度良好。

2.7 样品稳定性测试

精密量取2.1.1项下的样品溶液10 μl，2 h进样一次，即0、2、4、6、8、10 h。共6次，根据色谱峰面积计算，RSD=0.43。结果表明，样品溶液在10 h内稳定，可以满足测定要求。

2.8 重复性试验

取同批次（批号150313）平喘颗粒6份，按2.1.1项下制备的柚皮苷含量测定方法制备供试液。用液相色谱法测定峰面积并计算柚皮苷的含量。结果显示RSD为1.17＜2%。该方法测定平喘颗粒中柚皮苷的重现性好。见表6。

表6 重复性试验考察结果

2.9 加样回收率试验

按照2.1.1供试品溶液的制备项下同法称取本品约1 g，准确称量，放入带塞子的锥形瓶中，加入25 ml甲醇，盖上塞子，称重，超声处理30 min，冷却，用甲醇补充重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。取2.1.2项下对照品溶液（49.22 μg/ml），即得对照品溶液。依法测得柚皮苷溶液回收率（n=6），分别为94.7%、101.3%、99.1%、101.7%、98.8%、98.8%，RSD为2.5%，加样回收率良好。测定结果见表7。

表7 回收率试验结果

2.10 样品测定 取6批次平喘颗粒，按2.1.1项下制备样品溶液，既定色谱条件测定，记录色谱图，计算柚皮苷含量。方法学考察显示，在药材质量、生产条件等各项因素一致情况下，样品质量稳定。见表8。

表8 样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

平喘颗粒为本院制剂，疗效确切，方中枳壳为臣药，用量较大，其有效成分明确。查阅相关文献和药典记载，枳壳中有效成分为柚皮苷，HPLC测定平喘颗粒中柚皮苷的含量可作为该制剂的质控标准[1-8]。本研究表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液（0～20 min：18∶82；20～22 min：18～30∶82～70；22～32 min：30∶70）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长283 nm，对照品及样品中组分均能达到基线分离，柚皮苷溶液在0.082 5～0.984 4 g呈现出良好的线性关系，并且峰形良好：RSD=0.004 0＜2%，仪器精密度良好；供试品溶液在10 h内呈现良好稳定性，加样回收率良好，该制剂可用HPLC来控制药品质量，能够满足测定需要。因此，本实验建立的HPLC测定平喘颗粒中枳壳柚皮苷含量，经方法学和实验结果考察，达到药物检测要求，可用于中药处方平喘颗粒枳壳中柚皮苷的含量测定与质量评价，能够控制本院制剂平喘颗粒的质量，保障患者用药安全。