金龙胆草的体内及体外抗菌作用

高 垚 郭向群 潘立文 飞志红

金龙胆草又名矮脚金龙胆草、金蒿枝、鱼胆草等，是菊科白酒草属两年生草本植物，分布于攀西、云南及贵州部分地区，常生长于海拔600～2 800 m的山坡草地[1-2]。《中国彝族药学》记载，金龙胆草味苦，性寒，具有清热解毒，止血，止痛等功效。云南楚雄民间采集此药，内服外用，用于治疗扁桃体炎、中耳炎、肝炎、遗尿症等[3]。目前研究报道主要关注于对其化学成分及药理活性的研究。化学成分研究方面，金龙胆草主要含有萜类物质，包括三萜、二萜及其糖苷，此外还含有黄酮类、挥发油、有机酸、无机元素等有效成分，其中二萜化合物金龙胆草素为金龙胆草中的特征化合物[4]。药理作用方面，已有研究表明金龙胆草具有抗炎、抗溃疡、抗菌、抗肿瘤作用[5-6]。王寅生等[7]的研究表明，金龙胆草乙醇提取液对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性，但目前为止，仍未有金龙胆草体内抗菌作用研究。水煎液为民间惯用的金龙胆草药用剂型，因此，本研究就金龙胆草水煎液体外抗菌活性进行分析，并探索其对感染金黄色葡萄球菌小鼠模型皮肤脓肿的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 体外抑菌作用

1.1.1 材料 金龙胆草野生样本采集于云南省楚雄市东华镇；实验菌株购买于广东省微生物研究所；小白鼠购买于昆明医科大学实验动物部。

1.1.2 金龙胆草水煎液的提取 取已切割至约1 cm小段的干燥金龙胆草50 g于煎煮锅内，少量多次加入蒸馏水并不断搅拌，致干燥药物充分吸湿且锅底水量不多于5 ml，充分吸湿后，加入蒸馏水500 ml煮沸30 min，将第一次煮沸的药液倒出，继续加入500 ml水煎煮30 min后充分倒出煎煮液，将两次的煎煮液合并，过滤后将药液浓缩至100 ml，即最终的药物浓度为0.5 g/ml。

1.1.3 体外抑菌实验方法 体外抑菌实验采用方法为纸片扩散法，抑菌圈的大小可反映测试菌对检测药物的敏感程度。将抑菌实验中所用细菌分别传代3次备用；选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6 mm的圆形滤纸片，经高压灭菌后，将滤纸片放置于灭菌的浓度为0.5 g/ml金龙胆草水煎剂中浸泡2～3 h，同法制备0.9%氯化钠注射液滤纸片作为阴性对照。将传代3次后的细菌（大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌）挑取单菌落于牛肉汤液体培养基中，在37 ℃、130 r/min培养12 h，之后将菌液进行稀释，将稀释菌液均匀涂布于固体培养基上。将制备好的滤纸片放置于固体培养基上，于37 ℃培养箱中培养24 h后观察实验结果。

1.2 载体抗感染

1.2.1 材料 金龙胆草水煎液，浓度为0.2 g/ml；头孢克洛混悬液0.125 g/包；0.9%氯化钠注射液。小白鼠来源于昆明医科大学动物部的昆明鼠，体重在30～40 g。

1.2.2 动物准备 在实验条件下饲养一周，让小鼠适应饲养条件及环境。一周后对小鼠右侧腹部剃毛，暴露皮肤，备皮做好实验准备，并继续饲养2 d，观察小鼠活动状态正常。

1.2.3 菌液制备 金黄色葡萄球菌在固体培养基稳定传代3次后，挑取单菌落于37 ℃、130 r/min的牛肉汤培养基（牛肉膏3～5 g，蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 ml，调pH 7.4～7.6）中培养42 h，然后用灭菌0.9%氯化钠注射液清洗细菌，离心后用稀释平板计数法计算菌液浓度，再用灭菌0.9%氯化钠注射液调整其菌液浓度为（1.0～1.25）×109CFU/ml。

1.2.4 脓肿模型建立 将小鼠分为两组，脓肿建模阴性对照组（10只），向备皮后的小鼠皮下注射0.9%氯化钠注射液；脓肿建模组（30只），向备皮后的昆明小白鼠腹部皮下注射0.1～0.12 ml上述菌液，使注射菌液量达108CFU。将皮下注射菌液的小鼠继续饲养，24 h后，见阴性建模组无脓肿发生，而菌液建模组小鼠注射部位出现明显肿块，触之有明显扭体反应，脓肿模型建立成功并测量脓肿体积。本研究成功地建立了金黄色葡萄球菌皮肤脓肿小鼠模型，建模的30只小白鼠，全部形成脓肿包块，建模成功率高，而阴性对照组没有小鼠形成包块。

1.2.5 载体抗感染 将建模成功的30只小鼠分为3组，分别为阳性对照组、实验组、阴性对照组，每组10只，给药前各组小鼠脓肿体积无显著差异。阳性对照组给予药物头孢克洛灌胃，阴性对照组用0.9%氯化钠注射液灌胃，实验组用金龙胆草水煎液灌胃。

阳性对照组：按照金龙胆草水煎液浓度为0.2 g/ml，成人用药量20 g/次计算，根据公式（D鼠=D人×K鼠/K人×W人/W鼠；K鼠=9.1；K人=1.6；W鼠=0.04 kg；W人=50 kg计算。注：D代表剂量；K代表人/鼠的等效剂量比值；W代表体重）计算得小鼠给药剂量为0.091 g/次，即给药量为450 μl/次，3次/d。考虑给药的方便性及准确性，每次取0.125 g/包的头孢克洛混悬液溶解于50 ml蒸馏水中，算得每只小鼠的灌胃药量为400 μl/次。

阴性对照组：0.9%氯化钠注射液450 μl/次，3次/d。

实验组：取已切割至约1 cm小段的干燥金龙胆草40 g于煎煮锅内，少量多次加入蒸馏水并不断搅拌，致干燥的药物充分吸湿且锅底余水量不多于5 ml，充分吸湿后，加入蒸馏水200 ml煮沸30 min，将第一次煮沸的药液倒出，继续加入200 ml水煎煮30 min后充分倒出煎煮液，将两次的煎煮液合并，过滤后将药液浓缩至200 ml，即最终的药物浓度为0.2 g/ml。采用浓度为0.2 g/ml的金龙胆草水煎剂，每次给药量为450 μl，3次/d。

建模成功后，每日记录小鼠体重及脓肿体积变化（脓肿体积计算方法：脓肿体积=π/6×长径距离×短径距离），灌胃6 d。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，体外抑菌实验数据采用方差分析，采用t检验进行给药前后体重差异性检验，采用重复检测方差分析对不同组间脓肿变化差异进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外抑菌实验结果

实验用传代3次的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌）进行体外抑菌实验，每个菌株6个平行孔，为防止实验误差，以0.9%氯化钠注射液作为阴性对照。金龙胆草水煎液浓度为0.5 g/ml时，对金黄色葡萄球菌表现出极强的抑制作用，抑菌圈直径为（28.37±4.92）mm；对枯草杆菌中度敏感，抑菌圈直径（13.89±0.71）mm；对大肠杆菌不敏感，抑菌圈直径为0。见图1、表1。

图1 金龙胆草体外抑菌效果

表1 体外抑菌实验抑菌圈直径(mm)

2.2 金黄色葡萄球菌皮肤脓肿小鼠模型研究结果

给药前，3组小鼠脓肿体积比较差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后，实验组脓肿体积最小，阳性对照组次之，而阴性对照组脓肿体积最大，3组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。3组小鼠给药前后体重、活动情况、进水、进食量无明显变化。

表2 3组大鼠给药前后脓肿体积比较(mm2,±s)

表2 3组大鼠给药前后脓肿体积比较(mm2,±s)

组别 只数 给药前 给药后阳性对照组 10 323.70±149.53 762.00±328.69阴性对照组 10 321.84±201.11 1 076.90±182.64实验组 10 276.43±136.82 406.40±375.04

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌可通过多种途径侵入机体，形成以脓肿为主的各种化脓性炎症，常见的皮肤化脓性感染如疖、痈、甲沟炎、伤口化脓等，主要临床表现为红、肿、热、痛，且金黄色葡萄球菌在医院感染以及社区获得性感染中发挥着至关重要的作用，可导致机体出现皮肤软组织感染、呼吸道感染、泌尿系统感染以及败血症等。美国疾病控制中心报告指出，由金黄色葡萄球菌引起的感染仅次于大肠杆菌，其是人类化脓感染中最常见的病原菌[8-11]。近年来，随着临床上抗菌药物的滥用，金黄色葡萄球菌对相关抗菌药物的耐药性显著增加，其产生的一种酶可以水解β-内酰胺环进而对青霉素产生耐药性[12]。甲氧西林研发出来后替代了青霉素用于金黄色葡萄球菌感染的治疗，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）也越来越多地被国内外发现，甚至万古霉素中介金黄色葡萄球菌（VISA）和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）的报道也逐渐增多[13-14]。目前，临床将MRSA感染、艾滋病和乙型病毒性肝炎称为当今世界三大感染性疾病，对患者的生命健康安全造成了极大的威胁，临床急需寻找能对抗金黄色葡萄球菌的新型抗感染药物。

中草药为传承千年的传统药物，现研究证明，大多数寒凉类药物具有抗感染作用，如金银花、连翘、大青叶、板蓝根[15-16]。金龙胆草味苦、性寒，记载其水煎液对很多炎症性疾病有治疗作用，而导致炎症发生的最主要因素为感染[4]。因此，本研究在成功建立金黄色葡萄球菌小鼠皮肤感染模型的基础上，用有体外抗金黄色葡萄球菌作用的金龙胆草水煎液进行体内抗菌作用研究，观察其对金黄色葡萄球菌所致脓肿的治疗作用。

本研究中，体外抑菌作用研究表明0.5 g/ml金龙胆草水煎液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌抑菌作用不同，其中对金黄色葡萄球菌表现出极强的抑制作用，对枯草杆菌中度敏感，对大肠杆菌不敏感。采用浓度为0.2 g/ml的金龙胆草水煎液进行金黄色葡萄球菌皮肤感染小白鼠模型研究，金龙胆草组脓肿体积明显缩小，且体积缩小程度较头孢克洛显著，说明金龙胆草水煎液灌胃对金黄色葡萄球菌感染小白鼠模型的脓肿消除作用强于头孢克洛。浓度为0.2 g/ml的金龙胆草水煎液灌胃对小鼠体重无影响。

本研究先证明金龙胆草水煎液有非常强的体外抗菌活性，在此基础上，成功建立金黄色葡萄球菌皮肤感染小鼠模型，用具有抗金黄色葡萄球菌作用的头孢克洛为阳性对照，采用金龙胆草水煎液进行载体抗感染研究，以灌胃给药的方式给药，结果表明金龙胆草水煎液在体内同样具有治疗小鼠金黄色葡萄球菌感染皮肤脓肿的作用。金龙胆草为稀缺中药材，随着其人工栽培技术、内生真菌发酵、创愈组织诱导培养等技术的不断研究探索，将可以有效解决野生金龙胆草来源不足的问题[16-18]，而其对金黄色葡萄球菌极强的抑制作用，有利于为金黄色葡萄球菌抗菌药物的中药成分筛选及临床应用奠定基础，以期发现新的抗菌活性成分，解决临床金黄色葡萄球菌耐药现状。