高效液相色谱法同时测定山七降酯通脉胶囊中金丝桃苷和槲皮素的含量

何蓉蓉 吴韶辉 刘旺培 陈华龙 李庆德 彭 晶 郭艳琼

山七降酯通脉胶囊为医院制剂，由三七、山楂、丹参、桑寄生等8味药材经加工制成，具有补肝肾，活血化瘀，降血脂，抗动脉粥样硬化等功效。山楂为该制剂中的君药，桑寄生为该制剂中的辅佐成分。金丝桃苷和槲皮素为山楂的主要成分[1]，槲皮素为桑寄生的主要成分[2]。本文研究中参考文献[3-10]，建立了同时测定山七降酯通脉胶囊中金丝桃苷和槲皮素含量的高效液相色谱法，该方法简便、快速、准确、重现性好，为更好地监控和评价山七降酯通脉胶囊的质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪；XS105Du电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

对照品：金丝桃苷（批号：111527-201809，含量：94.9%）、槲皮素（批号：100081-201610，含量：99.1%）购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。样品由粤北人民医院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Thermo Aquasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，0.5%磷酸水为流动相B，梯度洗脱（0～15 min：15%A～18%A；15～29 min：18%A～23%A；29～55 min：23%A～32%A）；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μl；波长：370 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品储备液的制备 分别精密称取金丝桃苷22.70 mg置20 ml量瓶中，槲皮素对照品107.23 mg置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度；分别精密移取金丝桃苷对照品溶液1.0 ml、槲皮素对照品溶液2.0 ml置同一100 ml量瓶中，加入70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。

2.2.2 对照品溶液的制备 取混合对照品储备液2.5 ml置20 ml容量瓶中，加入70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取山七降酯通脉胶囊粉末，研细，精密称取细粉（约2 g），置50 ml容量瓶中，加70%甲醇约40 ml，超声30 min，用70%甲醇稀释到刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取不含山楂、桑寄生的山七降酯通脉胶囊粉末，研细，精密称取细粉（约2 g），置50 ml容量瓶中，加70%甲醇约40 ml，超声30 min，用70%甲醇稀释到刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜滤过，取滤液作为阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，结果表明：供试品溶液中有与金丝桃苷对照品和槲皮素对照品保留时间一致的色谱峰，阴性样品溶液中无相应的色谱峰，本品专属性良好。见图1～3。

图1 对照品溶液色谱

2.3.2 线性关系考察与定量限 精密吸取混合对照品储备液适量，置10 ml量瓶中，加70%甲醇稀释的系列浓度（金丝桃苷0.336 6、0.673 2、1.346 4、2.692 8、5.385 6、10.771 2 μg/ml；槲皮素0.664 2、1.328 3、2.656 6、5.313 2、10.626 5、21.253 0 μg/ml）的混合对照品溶液；精密吸取各系列浓度的混合对照品溶液20 μl进行测定，以浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析结果见表1，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

图2 供试品溶液色谱

表1 标准曲线测定、最低定量限检测结果

2.3.3 仪器精密度 取同一混合对照品溶液，连续进样6次，各成分色谱峰峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.9%、0.4%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品（批号为20190315），研细，取6份，精密称定（约2 g），依“2.3”项下的方法制得样品溶液，进样测定，结果6份样品各成分之间的RSD分别为1.4%、1.2%（n=6），说明本方法的重现性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份样品溶液（批号为20190315），分别在0、6、12、24 h进样测定，各成分色谱峰峰面积的RSD分别为2.7%、1.2%，结果表明样品在24 h内稳定。

2.3.6 回收率试验 取同一批样品（批号为20190315），研细，取9份，精密称定（约1 g），精密加入混合对照品溶液适量，依“2.2.3”项下的方法制得供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果表明本方法的回收率较好。见表2。

表2 山七降酯通脉胶囊加样回收率试验结果

2.3.7 样品含量的测定 分别取不同批次的样品，按照2.2.3实验方法进行操作，按2.1实验条件进行测定，代入线性回归方程，计算金丝桃苷、槲皮素的含量。见表3。

表3 不同批号样品测定结果(μg/g)

图3 阴性样品溶液色谱

3 讨论

3.1 提取条件的选择

对提取溶剂（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇）进行比较，结果70%甲醇提取率高，提取的成分多，且各成分在色谱系统中分离度较好。

3.2 液相条件的选择

3.2.1 流动相的选择 实验比较了乙腈-0.5%磷酸水、乙腈-0.5%醋酸水、乙腈-0.05 moL/L磷酸二氢钾（磷酸调pH至3.0）水溶液、乙腈-0.05 moL/L醋酸铵水溶液等多种流动相，发现选择乙腈-0.5%磷酸水为流动相，实验条件简单，各色谱峰能达到良好的分离，也可更好地保护液相色谱仪。

3.2.2 波长的选择 实验比较了210 nm、254 nm、360 nm、370 nm波长，发现选择370 nm条件下，基线无干扰，色谱峰的峰形、分离度及出峰数量等方面较好。

3.2.3 色谱柱的选择 实验比较了Thermo Aquasil C18色谱柱、Phenomenex luna C18色谱柱、JADE-PAK KM-C18色谱柱，发现使用各种色谱柱，该色谱条件下化合物均能达到良好的分离。

3.3 样品分析

样品测定结果表明3批样品中金丝桃苷和槲皮素的含量差异不大，说明各批次产品的差异性不大。

综上所述，建立山七降脂通脉胶囊HPLC色谱条件，分别测定制剂中山楂、桑寄生的有效成分金丝桃苷、槲皮素的含量。结合原制剂标准中山楂、丹参、泽泻、桑寄生的薄层鉴别建立质量控制标准操作规程，保证山七降脂通脉胶囊质量的稳定性、有效性和可控性。