扶正抑癌苗方颗粒的质量控制研究

晏 琴 李 江* 刘 炜 刘顶鼎

扶正抑癌苗方颗粒系贵州中医药大学知名老中医刘自平教授的临床经验方研制而成的中药制剂，具有多年临床使用经验；是由黄芪、南沙参、仙鹤草、法半夏、薏苡仁、白花蛇舌草、余甘子、吉祥草、冬凌草等12味中药饮片制成的颗粒剂。该制剂有益气养阴、解毒散结的功效，适用于气阴两虚型肺癌患者。该制剂前期已由贵州中医药大学第二附属医院呼吸内科刘炜主任医师课题组经动物实验验证能抗小鼠Lewis肺癌转移及肿瘤血管生成，具有很好的抗癌作用[1]。黄芪具有益气升阳，解毒散结之功效，适用于气虚乏力，中气下陷等，其主要药效成分为多糖类化合物[2-3]。南沙参性微寒，归肺、胃二经，具有养阴生津，化痰益气之功效，应肺脏“喜润恶燥”的生理特性，两者合用共为君药。法半夏为臣药，具有燥湿化痰之功效，用于痰多咳喘，痰饮昡悸，风痰眩晕等[2]。余甘子清热润肺生津，白花蛇舌草和薏苡仁配伍以清热解毒，化痰散结；另以吉祥草、冬凌草合用清热解毒，理血化瘀；仙鹤草收敛止血以治其标。本研究旨在建立扶正抑癌苗方颗粒中法半夏、薏苡仁、吉祥草、冬凌草、仙鹤草的薄层色谱鉴别方法，及以鸟苷为指标的定量研究方法，为其临床用药安全有效提供参考价值，同时为制定扶正抑癌苗方颗粒质量标准提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

三用紫外线分析仪（ZF-1型，上海金鹏分析仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（101-1A型，天津市泰斯特仪器有限公司）、电子分析天平（MS105DU，万分之一）、数显恒温水浴锅（DRHH-S4，上海双捷实验设备有限公司）、超声波清洗器（SK5200H，上海科导超声仪器有限公司）、岛津LS-2030型高效液相色谱仪。

1.2 试药

半夏对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121272-201806，规格：20 mg/瓶，薄层鉴别用）、薏苡仁对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121254-202105，规格：20 mg/瓶，薄层鉴别用）、吉祥草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121314-201603，规格：20 mg/瓶，薄层鉴别用）、迷迭香酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111871-201706，规格：20 mg/瓶，纯度：90.5%，含量测定用）、仙鹤草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120966-201908，规格：20 mg/瓶，薄层鉴别用）、鸟苷对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号：AF20073152，规格：20 mg/支，纯度：99.3%，含量测定用）。扶正抑癌苗方颗粒为自制，处方所需12味中药饮片均购自贵州中医药大学第二附属医院，经薄层色谱鉴别均为正品。甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯；实验用水为纯化水。

2 方法及结果

2.1 扶正抑癌苗方颗粒的定性研究

2.1.1 扶正抑癌苗方颗粒的制备 按处方量称取12味中药饮片，加12倍量水煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩，加适量可溶性淀粉制成颗粒，即得。为有效验证本研究重复性试验，按扶正抑癌苗方颗粒制备方法制备3个不同批次的样品备用（批号：20210728、20210729、20210730）。

2.1.2 法半夏的薄层色谱鉴别

2.1.2.1 样品制备 供试品溶液制备：分别取3批扶正抑癌苗方颗粒适量，研细后，称取粉末5 g，置于锥形瓶中，量取30 ml甲醇，加入锥形瓶中，80 ℃加热回流1 h，放冷，过滤，滤液蒸干，取乙醚15 ml完全溶解，过滤，滤液蒸干，取甲醇1 ml使溶解，即得。对照药材溶液的制备：取半夏对照药材2 g，置于锥形瓶中，按 “供试品溶液制备”项下制备方法，制成半夏对照药材溶液。阴性供试品溶液的制备：按扶正抑癌苗方工艺，制备出缺法半夏的阴性制剂，同“供试品溶液制备”项下制备方法制成缺法半夏的阴性供试品溶液。

2.1.2.2 显色条件 参照《中华人民共和国药典》2020版四部附录（通则0502），用毛细管吸取上述3批供试品溶液、半夏对照药材溶液、缺法半夏阴性供试品溶液各10 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上；以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－冰醋酸（10∶7∶0.1）为展开剂，待薄层板充分饱和后，展至约8 cm，取出，晾干，喷显色剂：10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰[4]。

2.1.2.3 结果 3批扶正抑癌苗方颗粒供试品色谱在薄层板上所呈现的主斑点与对照药材相应位置上的色谱斑点显相同的桃红色，而且阴性对照未出现干扰。见图1。

图1 扶正抑癌苗方颗粒中法半夏的薄层色谱

2.1.3 薏苡仁的薄层鉴别

2.1.3.1 样品制备 供试品溶液制备：分别取3批扶正抑癌苗方颗粒各5 g，研细，置于烧杯中，加水20 ml，搅拌使其溶解，转移至分液漏斗中，摇匀，用乙酸乙酯（15 ml）振摇提取2 次，收集乙酸乙酯液，蒸至约2 ml，作为供试品溶液。对照药材溶液的制备：取薏苡仁对照药材2 g，置100 ml锥形瓶中，加乙酸乙酯20 ml，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸至约2 ml，即得。阴性供试品溶液的制备：按扶正抑癌苗方工艺，制备出缺薏苡仁的阴性制剂，同“供试品溶液制备”项下制成缺薏苡仁的阴性供试品溶液。

2.1.3.2 显色条件 照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2020版四部附录（通则0502），用毛细管吸取上述3个批号的供试品溶液、对照药材溶液、缺薏苡仁阴性供试品溶液各5 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－乙酸（10∶3∶0.1）为展开剂，充分饱和后，展至约8 cm，取出，晾干，置紫外线灯（365 nm）下检视[5]。

2.1.3.3 结果 3批扶正抑癌苗方颗粒供试品色谱在薄层板上所呈现的荧光主斑点与对照药材相应位置上的色谱荧光斑点显相同的淡蓝色荧光，而且阴性对照未出现干扰。见图2。

图2 扶正抑癌苗方颗粒中薏苡仁的薄层色谱

2.1.4 吉祥草的薄层鉴别

2.1.4.1 样品制备 供试品溶液制备：分别取3批扶正抑癌苗方颗粒5 g，研细，置于3个锥形瓶中，加甲醇30 ml，超声30 min，过滤，滤液蒸至约2 ml，即得。对照药材溶液的制备：取吉祥草对照药材2 g，加甲醇10 ml，同“供试品溶液制备”项下制备方法，制成对照药材溶液。阴性供试品溶液的制备：按扶正抑癌苗方工艺，制备出缺吉祥草的阴性制剂，同“供试品溶液制备”项下制备方法制成缺吉祥草的阴性供试品溶液。

2.1.4.2 显色条件 照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2020版四部附录（通则0502），用毛细管吸取上述3批供试品溶液、对照药材溶液及缺吉祥草阴性供试品溶液各5 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）－乙酸乙酯（8∶1）为展开剂，充分饱和后，展开至约8 cm，取出，晾干，置紫外线灯（365 nm）下检视[6]。

2.1.4.3 结果 3批扶正抑癌苗方颗粒供试品色谱在薄层板上所呈现的荧光主斑点与对照药材相应位置上的色谱荧光斑点显相同的浅绿色荧光斑点，而且阴性对照未出现干扰。见图3。

图3 扶正抑癌苗方颗粒中吉祥草的薄层色谱

2.1.5 冬凌草的薄层鉴别

2.1.5.1 样品制备 供试品溶液制备：分别取3批扶正抑癌苗方颗粒适量，研成细粉，各称取5 g，置于3个锥形瓶中，加水10 ml，搅拌均匀，过D101大孔树脂柱（内径1 cm，高约15 cm）；先用40 ml水洗脱，弃去水液，再用40 ml甲醇洗脱，收集甲醇溶液，蒸至约2 ml，即为供试品溶液。对照品溶液的制备：精密称定1 mg迷迭香酸对照品，加甲醇制成每1毫升含1 mg的溶液，即为对照品溶液。阴性供试品溶液的制备：按扶正抑癌苗方工艺，制备出缺冬凌草的阴性制剂，同“供试品溶液制备”项下制备方法制成缺冬凌草的阴性供试品溶液。

2.1.5.2 显色条件 照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2020版四部附录（通则0502），用毛细管吸取3批供试品溶液、迷迭香酸对照品溶液及缺冬凌草的阴性供试品溶液各5 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸（6∶4∶1）为展开剂，待薄层板充分饱和后，展开至约8 cm，取出，晾干，以5%三氯化铝－乙醇溶液为显色剂，置紫外线灯（365 nm）下检视[7]。

2.1.5.3 结果 3批扶正抑癌苗方颗粒供试品色谱在薄层板上所呈现的荧光主斑点与对照品相应位置上的色谱荧光斑点显相同的蓝色荧光斑点，而且阴性对照未出现干扰。见图4。

图4 扶正抑癌苗方颗粒中冬凌草的薄层色谱

2.1.6 仙鹤草的薄层鉴别

2.1.6.1 样品制备 供试品溶液制备：分别取3批扶正抑癌苗方颗粒适量，研成细粉，称取5 g，加入丙酮-乙酸乙酯（4∶1）50 ml，超声处理30 min（功率250 W，频率33 kHz），滤过，滤液蒸至约2 ml，即为供试品溶液。对照药材溶液的制备：取仙鹤草对照药材2 g，同“供试品溶液制备”项下制备方法，制成对照药材溶液。阴性供试品溶液的制备：按扶正抑癌苗方工艺，制备出缺仙鹤草的阴性制剂，同“供试品溶液制备”项下制备方法制成缺仙鹤草阴性供试品溶液。

2.1.6.2 显色条件 照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2020版四部附录（通则0502），用毛细管吸取上述3批供试品溶液、对照药材溶液、缺仙鹤草的阴性供试品溶液各10 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－氨水－乙酸乙酯－甲醇（8∶0.5∶2∶3）为展开剂，待薄层板充分饱和后，展开至约8 cm，取出，晾干，至紫外灯（254 nm）下检视[8]。

2.1.6.3 结果 3批扶正抑癌苗方颗粒供试品色谱在薄层板上所呈现的荧光主斑点与对照药材相应位置上的色谱荧光斑点显相同的红色荧光斑点，而且阴性对照未出现干扰。见图5。

图5 扶正抑癌苗方颗粒中仙鹤草的薄层色谱

2.2 扶正抑癌苗方颗粒的定量研究（法半夏中鸟苷的含量测定）

2.2.1 色谱条件 采用Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为水（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min：99.5%A→99%A；10～15 min：99%A→98.5%A；15～30 min：98.5%A→94.5%A；30～35 min：94.5%A→90%A），平衡时间为15 min，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl，检测波长265 nm[9-11]。

2.2.2 对照品溶液的制备 取鸟苷对照品适量，精密称定，置5 ml量瓶中，加水适量使其溶解，用水定容至刻度，摇匀，制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定扶正抑癌苗方颗粒5 g，置于100 ml具塞锥形瓶中，加纯化水20 ml，称重，超声30 min，放冷，再称重，用纯化水补足减失的量，转移至25 ml量瓶中，用纯化水定容至刻度。

2.2.4 阴性对照品溶液制备 按处方量制备不含法半夏的扶正抑癌苗方颗粒，精密称取扶正抑癌苗方颗粒5 g，按“2.2.3供试品溶液的制备方法”项下制备不含法半夏的阴性供试品溶液。

2.2.5 专属性考察 按处方制备工艺制备不含法半夏的扶正抑癌苗方颗粒，按“2.2.3供试品溶液的制备”项下处理方法，制得缺法半夏的阴性供试品溶液。精密吸取阴性供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.2.1色谱条件”项下条件进行测定，并记录色谱图。见图6～8。

图6 鸟苷对照品的高效液相色谱

2.2.6 线性关系考察试验 精密称取鸟苷对照品10.20 mg置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配成浓度为0.399 84 mg/ml的对照品溶液。分别精密量取浓度为0.399 84 mg/ml的鸟苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 ml至10 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，配成浓度为0.019 992、0.039 984、0.059 976、0.079 968、0.099 960、0.119 952 mg/ml的一系列对照品溶液，分别进样10 μl，以峰面积（Y）为纵坐标，鸟苷浓度（X）为横坐标，得回归方程为：Y=7E+06X-7 409.7，r= 0.999 2。见图9。

图9 鸟苷对照品标准曲线

2.2.7 精密度试验 精密用毛细管吸取鸟苷对照品溶液（99.96 μg/ml）10 μl，在“2.2.1色谱条件”项下条件同时进样6次，测得鸟苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.34%。试验结果表明仪器的精密度良好。

2.2.8 重现性试验 取同一批号的扶正抑癌苗方颗粒，用研钵研细，精密称取5 g，共平行称取6份，按“2.2.3供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，在“2.2.1色谱条件”项下条件进行测定，精密吸取供试品10 μl，测得峰面积积分值，并计算含量，结果平均含量为0.283 1 mg/g，RSD为1.74%。结果表明本方法重现性良好。

图7 供试品溶液的高效液相色谱

图8 缺法半夏的阴性溶液的高效液相色谱

2.2.9 稳定性试验 精密吸取按“供试品溶液的制备”项下方法制备的同一批供试品溶液10 μl，在0～48 h内，按“2.2.1色谱条件”项下条件进行测定，分别在0、2、4、8、12、24、48 h进样1次，测定鸟苷峰面积，计算RSD为0.98%。结果表明扶正抑癌苗方颗粒在48 h内稳定。

2.2.10 加样回收试验 取已知样品含量的用同一批号的扶正抑癌苗方颗粒，研细，精密称取5 g，共9份，置于100 ml具塞锥形瓶中，分别加入低（0.049 98 mg/ml）、中（0.099 96 mg/ml）、高（0.149 94 mg/ml）3种不同浓度鸟苷对照品溶液，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，冷却，称定重量，分别用低（0.024 99 mg/ml）、中（0.049 98 mg/ml）、高（0.099 96 mg/ml）3种不同浓度鸟苷对照品溶液补足减失的重量，转移至25 ml容量瓶中，用低（0.049 98 mg/ml）、中（0.099 96 mg/ml）、高（0.149 94 mg/ml）3种不同浓度鸟苷对照品溶液定容至刻度。摇匀滤过，取续滤液，即得。按“2.2.1色谱条件”项下条件进样10 μl，并按下列公式计算回收率。结果表明平均回收率为100.93%，RSD为1.60%，加样回收良好，说明本方法准确度较高。见表1。

表1 回收率试验(n=9)

3 讨论

扶正抑癌苗方颗粒中处方饮片化学成分复杂，且缺乏有效质量控制指标，故本研究通过薄层色谱方法对法半夏、薏苡仁、吉祥草、冬凌草、仙鹤草进行了定性研究，建立了重现性好、专属性强、且没有阴性干扰的鉴别方法。在法半夏的定性研究中，考察了不同处理方法和展开剂，最终将供试品回流1 h，以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－冰醋酸（10∶7∶0.1）为展开剂，能有效提高分离度。薏苡仁的鉴别中对展开剂进行过考察，结果显示以石油醚（60～90 ℃）－乙酸乙酯－乙酸（10∶3∶0.1）为展开剂，效果更好，且需用36%乙酸，斑点显色更明显。吉祥草的鉴别中对薄层板进行了考察，结果显示以硅胶G薄层板，斑点显色清晰且分离度较好；提取方法考察了回流与超声，结果显示，两种提取方法对结果影响不大，故选用超声提取。冬凌草的鉴别中，曾以冬凌草对照药材进行对照，但与迷迭香酸对照品相比，显色不明显，故冬凌草的鉴别选用迷迭香酸对照品；另考察显色剂的浓度，结果表明以5%的三氯化铝-乙醇溶液为显色剂，对应的斑点显色更清晰。在对仙鹤草的薄层色谱鉴别中，考察了不同展开剂，最终确定以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－氨水（8∶2∶3∶0.5）为最佳展开系统。

另外实验前期采用薄层色谱鉴别方法对方中中药饮片均进行过研究，但由于斑点显色不清晰，或存在阴性干扰，最终以扶正抑癌苗方颗粒为研究对象，筛选出5味中药饮片的定性研究方法，对组方中法半夏、薏苡仁、吉祥草、冬凌草、仙鹤草进行了薄层色谱鉴别研究；其方法简便易行，分离斑点清晰，阴性对照无干扰，重现性好，专属性强。

定量研究中，用一测多评法测定半夏中腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷的含量[12]；考察过不同柱温和流动相，但最终供试品中相应参照峰无法分开，且其中鸟苷含量最高，分离效果最好，故选择用鸟苷对照品为指标对扶正抑癌苗方颗粒进行质量控制研究。结果为建立扶正抑癌苗方颗粒的薄层色谱鉴别方法和含量测定研究方法提供了思路，基本完成了扶正抑癌苗方颗粒的质量控制研究，也为其临床用药安全有效提供了参考价值，为其进一步开发及临床应用奠定了良好的药学基础。