寒痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠IL-17和IL-23的影响

庞学丰，林 菊，黄政治，韦夏惠，李玉玲，吴燕红，王思思，廖家瑜，冯玉青

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种致残率高的慢性疾病，未经系统、规范治疗的晚期患者将会出现关节畸形和功能丧失［1］，目前尚无根治药物。研究表明，白细胞介素-17（IL-17）和白细胞介素-23（IL-23）在RA 的发病、发展中起着重要的作用，IL-17 与其他细胞因子如 IL-1、TNF-α 等相互作用，导致 RA 病变进展［2］；IL-23 是 RA 发病过程中重要的促炎因子之一，在RA 发病过程起着关键作用［3］。甲氨蝶呤是公认的治疗RA 疗效确切的药物，二甲双胍可以改善RA 模型小鼠关节症状，提示其具有治疗RA 的作用［4］。本实验采用CⅡ乳剂进行皮下注射成功诱导胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，选择甲氨蝶呤、二甲双胍作为对照药，观察不同剂量的寒痹康汤对CIA 大鼠血清IL-17 和IL-23的影响。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级Wistar 大鼠140 只，雌性，体质量（100±10）g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0013。大鼠在广西中医药大学动物实验中心进行适应性喂养，观察7 d 无异常后进行分组实验。

1.2 试药 寒痹康汤由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备成浸膏，临用时将浸膏加入溶液（由乙醇和生理盐水按比例组成）溶解，配制成浓度为2×10-7g/L 的溶液；甲氨蝶呤片（国药准字H22022674，通化茂祥制药有限公司）；二甲双胍（国药准字H13021647，河北天成药业股份有限公司）。

1.3 试剂 大鼠IL-17检测试剂盒（批号：P10031784，武汉华美生物工程有限公司）；IL-23 检测试剂盒（批号：38KJFDZI7C，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；弗氏不完全佐剂、牛Ⅱ型胶原蛋白均为美国Chondrex公司产品。

2 方法与结果

2.1 分组及造模 随机从140 只大鼠中选取20 只作为正常组，余120 只大鼠参照文献［5］方法注射CⅡ乳剂（将弗氏不完全佐剂和牛Ⅱ型胶原蛋白充分混匀后滴入水中呈油包水状）进行造模。造模时，分别在大鼠的颈部和背部注射0.2 ml的CⅡ乳剂，间隔2周后再注射CⅡ乳剂1 次。造模成功的判断标准［5］：大鼠四肢的足爪已经出现严重肿胀，且踝关节直径增长幅度≥2 mm。将造模成功大鼠随机分为模型组、甲氨蝶呤组、二甲双胍组及寒痹康汤高、中、低剂量组，每组20只。本实验研究对大鼠的各种处理均符合实验动物伦理学的相关要求。

2.2 给药 模型组大鼠予生理盐水灌胃，每天1 次；甲氨蝶呤组按13.5 mg/kg 的剂量灌服给予甲氨蝶呤药液，每周1次；二甲双胍组按1.35 g/kg的剂量灌胃给予二甲双胍药液，每天进行2 次；寒痹康汤高、中、低剂量组分别灌胃给予不同剂量的寒痹康汤（112.5 g/kg、56.25 g/kg、28.13 g/kg），每天灌胃2 次。高、中、低剂量参考文献［6］进行换算得出：即按70 kg 人体质量与200 g 大鼠的换算系数进行计算。各组灌胃容积均为20 ml/kg。正常组大鼠任其自由活动，不人为干扰其饮食与休息。

2.3 IL-17 和 IL-23 的检测 灌胃给药 36 d 后，用水合氯醛麻醉各组大鼠，腹主动脉采集大鼠血液，静置后，以 3 000 r/min 离心 10 min，收集血清放入 EP 管，后置于-80 ℃冰箱保存，以ELISA 法进行测定，按试剂盒说明进行。

2.4 统计分析 采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析或t检验。P＜0.05则表示差异有统计学意义。

2.5 各组大鼠血清IL-17和IL-23水平比较 见表1。灌胃给药36 d 后，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-17和IL-23的水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，甲氨蝶呤组、二甲双胍组及寒痹康汤高、中剂量组IL-17 和IL-23 的水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而寒痹康汤低剂量组IL-17 和IL-23 的水平略有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；寒痹康汤高、中剂量组疗效与甲氨蝶呤、二甲双胍相当，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠血清IL-17和IL-23水平比较 （pg/ml，）

表1 各组大鼠血清IL-17和IL-23水平比较 （pg/ml，）

注：与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常组模型组甲氨蝶呤组二甲双胍组寒痹康汤低剂量组寒痹康汤中剂量组寒痹康汤高剂量组n 剂量（g/kg）20 20 20 20 20 20 20- -0.0135 1.35 28.13 56.25 112.5 IL-17 44.251±6.523 104.209±8.136①63.348±9.735②64.402±9.768②95.413±6.452 66.283±8.046②62.121±5.053②IL-23 53.165±5.536 109.541±8.654①67.412±5.246②67.382±5.253②98.641±6.223 69.534±5.162②68.323±5.156②

3 讨 论

既往研究证实，在类风湿关节炎的发生、发展过程以及出现的骨质破坏和由此破坏产生的功能障碍，存在多种信号通路和炎性因子的共同参与。而白细胞介素-23/辅助性T细胞17介导的B细胞促炎性机制在RA的发生、发展过程中发挥重要作用［7］。

相关研究结果已表明，白细胞介素-17（IL-17）可以正反馈诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞产生白细胞介素-23（IL-23），致使骨破坏进程加速，（IL-17）A可导致破骨细胞的进一步分化和增殖加快，促进骨吸收，造成类风湿关节炎的关节软骨和骨的破坏［8］。IL-17A、IL-17F 均参与了包含RA 在内的自身免疫性疾病的炎症反应，导致了这些疾病的发生［9］。RA 发病情况下IL-23、IL-17 作为促炎症的细胞因子，在关节中有较高表达。在RA 的发病过程中，IL-23和IL-17在Th17细胞中形成IL-23/IL-17炎症轴，研究发现此炎症轴在RA的发病过程中发挥关键作用［10］。在类风湿关节炎中IL-23、IL-17、IL-6、IL-1、IL-33 水平升高，并且与RA 病情的严重程度、临床症状评分等有密切关联，可以作为诊断以及评估RA 病情和治疗效果的标志物［11］。

甲氨蝶呤是治疗RA 的临床常用药物之一，其疗效肯定，也是实验研究的常用对照药物。近年来许多学者进行了二甲双胍治疗RA 的相关研究，如郑魏等［12］发现二甲双胍可以促进RA患者外周血CD4+T淋巴细胞中Treg 细胞增长，使Th17/Treg 下降并且维持平衡状态，有利于病情的缓解，其安全性良好，副作用少。Fan等［13］通过实验证实二甲双胍能够抑制小鼠全身炎症和滑膜炎，能够抑制软骨层基质降解、破骨细胞形成以及软骨细胞凋亡，从而发挥骨保护作用。Matsuoka 等［14］研究表明，二甲双胍可以影响 RA 的发病机制，可能被用作治疗RA 的潜在治疗剂。基于以上认识，本课题组选择甲氨蝶呤、二甲双胍作为对照药物，观察不同剂量的寒痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清IL-17和IL-23的影响。

类风湿关节炎属于中医学的“痹病”范畴，中医认为正气亏虚是RA 发病的内在因素，而感受风寒湿邪为其发病的外在因素，治则应扶正祛邪。寒痹康汤为笔者治疗RA 的经验方，由补肾中药和抗风湿中药（秦艽、黄芪、防风、熟附子、麻黄、当归、青风藤、淫羊藿、狗脊）组成，全方具有补益肝肾、益气温经、祛风除湿、蠲痹止痛的功效，课题组成员经多年临床应用，表明本方治疗寒湿型RA疗效较好，且副作用少［15］，值得进一步研究。

本实验结果表明，寒痹康汤高、中剂量组能明显降低CIA 大鼠IL-17 和IL-23 水平，且与甲氨蝶呤组、二甲双胍作用相当（P＞0.05）。提示寒痹康汤可能通过降低CIA大鼠IL-17和IL-23水平而发挥治疗RA的作用。