直接进样/液相色谱—串联质谱法同时测定地表水中22 种典型抗生素

付晓燕 李振国 李志远 刘莲莲 杨硕 孙震 彭晓 夏莹

（1. 辽宁省大连生态环境监测中心，辽宁 大连 116023；2. 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，上海100015）

1 引言

近年来“超级细菌”在世界范围内频繁出现，抗生素环境污染问题日益突显，抗生素作为新污染物药物及个人护理品（PPCPs）中一类典型物质，因其在环境中易残留、较长半衰期和潜在生态危害大引起社会广泛关注，环境介质中抗生素污染正逐渐威胁人类及动物的生命安全［1-2］。目前抗生素被广泛用于预防和治疗人类及动物的各种疾病，同时也在畜禽养殖业和水产养殖业中被广泛应用为促生长药物［3］。环境中的抗生素主要来源于人和动物使用的抗生素，它们大部分会以原药或代谢物的形式经尿液和粪便排出［4］。环境介质中抗生素及其代谢物的长期残留和存在，迫使微生物对其产生耐药性，并最终通过食物链富集传递给人类和动物，威胁人类和动物健康。抗生素种类繁多，且新型抗生素被不断发明、生产及使用，目前常用的抗生素主要包括以下6 类：氯霉素类、β－内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、大环内酯类［5-8］。抗生素在环境水体中的浓度一般为痕量水平（ng/L），因此，快速准确测定环境水体中抗生素成为相关领域研究的关键。目前国内常见的主流抗生素分析方法需要对水样进行高倍数的富集浓缩才能进行检测，富集过程复杂，成本较高［9-10］，因此急需建立一种快速简单、灵敏度高、准确性好的抗生素检测方法，来提升抗生素的筛查检测能力。

本研究采用直接进样，高效液相色谱过滤，三重四极杆串联质谱检测技术，建立了地表水中6 类（β－内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类）22 种环境中常易检出的抗生素同时检测方法。本方法的优点是水样经PTFE 微孔滤膜过滤后直接进样，通过大体积进样，提高目标物的检测灵敏度，样品无需经过复杂的前处理过程，减少了目标物在固相萃取中的损失，使22 种目标物的回收率均大于80%，方法的检出限低至0.5～2.0 ng/L。将该方法应用于辽河流域60 余个地表水样品抗生素污染筛查，结果表明，该方法灵敏度高，重现性好，操作便捷，满足水质痕量22 种常见抗生素污染的快速检测及筛查要求。该方法的建立可为深入了解我国流域水环境中抗生素的赋存水平提供快速可靠的研究方法，为辽河流域生态风险评价提供科学依据。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱—三重四极杆线性离子阱串联质谱仪（QTRAPR6500＋LC－MS/MS，美国AB SCIEX公司）；Proshell 120 EC－C183 mm×100 mm，2.7 μm）；Milli－pore 纯水处理装置（美国Millipore 公司）；亲水性PTFE 微孔滤膜（0.22 μm，安谱公司）等。乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，国药集团药业股份有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、抗坏血酸（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。22 种抗生素标准品包括罗红霉素（ROX）、替米考星（TIC）、红霉素（ERY）、脱水红霉素（ERY－H2O）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFX）、恩诺沙星（ENR）、培氟沙星（PFLX）、土霉素（OTC）、四环素（TC）、金霉素（CTC）、强力霉素（DC）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺甲基嘧啶（SMZ）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺间甲氧嘧啶（SDM）、磺胺甲 唑（SMX）、氯霉素（CAP）、氟苯尼考（FFC）、甲氧苄胺嘧啶（TMP）、阿莫西林（AMX），以上标准品均购自百灵威科技有限公司，纯度均大于99.0%。上述标准品均用甲醇或乙腈配制成1 000 mg/L 的标准贮备液，并用甲醇或乙腈配制成10 mg/L 的22 种抗生素混合标准使用液，于－20 ℃冰箱冷冻储存。

2.2 样品的采集

2020 年10 月，采集了辽河流域地表水样品60余个，每个采样点采集水样1 L，加入250 mg 抗坏血酸，用盐酸调节pH 小于3［11-13］，置于棕色玻璃瓶中，4 ℃冷藏避光保存。

2.3 分析条件

液相色谱条件：流动相A 为0.1%（v/v）甲酸水溶液，B 为0.1%（v/v）甲酸乙腈；色谱柱Proshell 120 EC－C18，3 mm×100 mm，2.7 μm；流速0.8 mL/min；进样体积500 μL。流动相梯度洗脱程序：0～1.5 min，10%B～30%B；1.5 ～3.0 min，30%B～40%B；3.0 ～4.5 min，40%B～90%B，90%B 保持0.5 min；5.0～5.1 min，90%B ～10%B，10%B 保持2.5 min。

质谱条件：离子源为电喷雾电离（ESI）源，正/负离子切换模式；离子源温度600 ℃；多反应离子监测（MRM）模式；离子喷雾电压2 500～4 500 V；气帘气压力30.0 kPa；喷雾气压力45.0 kPa；辅助加热气压力45.0 kPa。22 种抗生素的其他相关质谱参数见表1。

表1 22 种抗生素检测质谱条件

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的优化

根据6 类抗生素分子结构中的基团特征，同时参考相关文献，最终选择ESI＋/－模式同时进行扫描，在MRM 模式下进行监测。将22 种目标物配成100 μg/L 标准溶液，采用一级质谱进行母离子扫描，［M＋H］＋/［M－H］－为准分子离子峰，依次优化离子源温度、离子喷雾电压、气帘气压力、喷雾气压力、辅助加热气压力、去簇电压，选择灵敏度最高的子离子，优化碰撞能量。最终选择22 种抗生素在MRM 下的质谱参数（见表1）。

3.2 色谱条件的优化

为保证22 种正负离子抗生素同时测定的峰型和灵敏度，提高分析的准确性，进一步优化流动相的组成，文献报道的抗生素检测流动相有酸性条件的乙腈—水、甲醇—水等，但甲醇洗脱能力较强，抗生素检测过程易出现共流出现象［14-15］。因此，选择酸性条件的乙腈—水为流动相，考察不同pH 对检测过程的影响。根据文献报道，考察乙腈—水、乙腈—0.2%（v/v）甲酸水溶液、乙腈—0.1%（v/v）甲酸水溶液、0.1%（v/v）乙腈—0.1%（v/v）甲酸水溶液，在ESI＋模式下，0.2%～0.1%（v/v）甲酸可以提高［M＋H］＋化合物的正离子响应，但0.2%（v/v）比0.1%（v/v）甲酸水溶液对负离子的抑制效应明显，且由于大体积进样，考虑流动相pH 的稳定性，同时正负离子均有较高灵敏度及较好峰型，最终选择0.1%（v/v）乙腈—0.1%（v/v）甲酸水溶液作为流动相。22 种抗生素（100 μg/L）的总离子流色谱图见图1。从图1 可以看出，22 种抗生素在10 min 内出峰完毕。

图1 22 种抗生素（100 μg/L）的总离子流图

3.3 方法评价

取50 mL 超纯水倒入50 mL 离心管中，加入25 mg EDTA，再加入15 μL 盐酸，制得溶液的pH 约为3，取该溶液逐级稀释配制浓度为0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.200，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0，20.0 ng/mL 的22 种抗生素混合标准溶液，用高效液相色谱—串联质谱检测后，以外标法定量，以峰面积为纵坐标（y）、目标物浓度为横坐标（x，ng/mL），绘制标准曲线。结果表明，在0.001～20.0 ng/mL 范围内，目标化合物的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，所有目标化合物的线性相关系数（r）均大于0.995。以信噪比（S/N）≥3 定义仪器的检出限（LOD），表明22 种抗生素的方法检出限为0.3～1.2 ng/L，部分化合物分析灵敏度比文献报道的方法提高了约1 个数量级。且前处理过程简单，无需经过繁琐的固相萃取过程，滤膜过滤后直接进样，因此该方法更简便，灵敏度更高，回收率更好。22 种抗生素测定标准曲线、检出限见表2。

表2 22 种抗生素测定标准曲线、检出限

3.4 样品制备

直接进样法：取50 mL 水样倒入50 mL 离心管中，加入25 mg EDTA，再加入15 μL 盐酸（36%～38%），制得水样的pH 为3，样品经过滤膜过滤后，500 μL进样。

3.5 实际水样分析

将建立的分析方法应用于辽河流域60 余个地表水水样的6 类22 种抗生素分析，60 余个采样点均有不同程度检出，检出率最高的点位的抗生素检出达14 种。流域内共检出17 种抗生素，环丙沙星、培氟沙星、磺胺甲基嘧啶、阿莫西林、氯霉素5 种抗生素未检出。其中，大环内酯类罗红霉素检出浓度最高，最高浓度为493 ng/L，其次是氯霉素类氟苯尼考，最高浓度为264 ng/L，再次是磺胺类磺胺甲唑，最高浓度为92 ng/L。实验结果表明，该方法对实际水样中抗生素的分析测定具有较好的应用及推广价值。

4 结论

本研究采用直接进样/液相色谱—串联质谱技术，与常见文献报道抗生素检测方法相对比，最大的优点是通过仪器性能提升，大体积直接进样，在保证检测灵敏度的基础上，极大地节省了样品前处理的时间及成本，且最大程度保证了各种目标物的回收率。本研究通过优化目标化合物的色谱条件、质谱条件、样品的pH 以及不同材质的滤膜选择等，建立了地表水中6 类共22 种抗生素同时分析测定方法，方法检出限在0.3～1.2 ng/L 之间，加标回收率在80.4%～113.0%之间。该方法成功地应用于辽河流域地表水中抗生素分析，共检出17 种抗生素，其中大环内酯类、磺胺类及氯霉素类检出浓度及检出率最高。结果表明，该方法操作简单、灵敏度高、准确度较好，为地表水中典型抗生素的分析提供了一种快速、准确可靠的分析方法。