调督理筋针法联合揿针对腰椎间盘突出症大鼠Akt/GSK3β通路及痛觉过敏的影响❋

郑丽娅，贾松涛，乔兆辉，朱学亮，牟成林，沈向楠，武佐元△

(1.邢台市人民医院，河北 邢台 054000；2.河北省中医院，石家庄 050000；3.内丘县中医院，河北 邢台 054200)

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation，LDH)是临床常见的疾患之一，主要是因腰椎间盘髓核部位发生退行性改变，引起纤维环破裂、髓核从破裂处突出或脱出、相邻脊神经根遭受到压迫或刺激，进而产生的腰部疼痛、下肢疼痛、坐骨神经痛等一系列临床症状，对患者的生活质量造成较大影响[1，2]。LDH髓核病变常会导致病理性神经痛，使机体对疼痛的敏感度增高。最近的研究显示，突出髓核受到压迫的神经根、脊神经节等引发的炎症反应均可引起机体痛觉过敏[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)通路与炎性细胞的分泌及迁移密切相关。资料显示，Akt参与神经病理疼痛形成、维持过程，GSK3β是GSK3的一个亚型，是Akt的下游效应分子，活化的Akt使GSK3β发生磷酸化，高表达的GSK3β对机体炎症反应具有增加作用，因此推测活化的Akt/GSK3β通路对于LDH所致机体痛觉过敏可能有不利影响[4-6]。中医认为LDH是由于感染风、寒、湿等导致气血运转不畅、劳累、瘀血等，最终发展为腰痛[7]，调督理筋针法是通过调督经脉、理筋通络等方法使机体经脉通畅、气血旺盛，从而达到缓解腰疼的作用[8]。揿针疗法具有固定性好、刺激强烈等优点，对于肩周炎、LDH等经络病具有一定的疗效[9]。本文通过建立LDH大鼠模型，研究调督理筋针法联合揿针对LDH大鼠痛觉过敏及Akt/GSK3β通路的影响。本研究通过邢台市人民医院伦理委员会审查(批准号LLSH2020027)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康SD雄性大鼠约3月龄，体质量270～310 g，购自北京科兴中维生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(京)2019-0027。所有实验大鼠于邢台市人民医院动物房中饲养，相对湿度55%，温度25 ℃，自然光照，自由进食饮水，每周清洁一次鼠笼、保持动物房环境通风、整洁，每天更新食物及饮用水，适应性喂养1周。

1.2 主要试剂及仪器

苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司，批号E607218-0200)；大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、兔抗鼠Akt、GSK3β、磷酸化Akt(phosphorylated-Akt，p-Akt)、磷酸化GSK3β(phosphorylated-GSK3β，p-GSK3β)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、羊抗鼠二抗(批号ab160017、ab30227、ab208348、ab197742、ab234570、ab00271、ab09767、ab181602、ab150077，美国Abcam公司)；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒(上海碧云天公司，批号P0027、P0011)等。

37450爪触觉测试仪、38450电子触觉测量仪、37370足底热刺激仪，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；RM2125RTS手动轮转式切片机，德国Leica公司；SMZ745光学显微镜，日本尼康公司；XElx800酶标仪，美国Perkin Elmer公司；1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot SD半干转膜仪，美国Bio-Rad公司；GIS-500凝胶成像仪，杭州米欧仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LDH动物模型制备 按参考文献[10]制备LDH大鼠模型，将100只大鼠按照随机数字表法分为假手术组20只和LDH组80只。腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)将大鼠麻醉，除去背部毛发并进行皮肤消毒，在背部正中以L5棘突为中心行纵向切口，依次切开皮肤、腰背筋膜、肌肉，暴露双侧L4、L5椎板并切除L4半椎板、下关节突和L5上关节突，暴露右侧L4、L5背根神经节，于鼠尾近根部切断尾椎并取出髓核，将髓核移植到右侧L4、L5神经节周围，不造成机械压迫，缝合伤口，术后3 d每只大鼠每日注射一次青霉素(4×105U)防止感染，假手术组仅暴露双侧L4、L5椎板。

1.3.2 分组及治疗方法 将建模成功的LDH大鼠模型按照随机数字法分为模型组、调督理筋针法治疗组(以下简称调督组)、揿针治疗组(以下简称揿针组)、调督理筋针法联合揿针治疗组(以下简称联合组)，每组各20只。治疗组于造模后第5天开始干预。调督组以手捻针针刺腰阳关、后溪、命门、肾俞、腰部夹脊、大肠俞、八髎，每5 min行针1次，留针30 min；揿针组在对应穴位行揿针埋针法；联合组在调督理筋针法治疗的基础上运用揿针留针治疗，对应穴位针刺后行揿针留置24 h处理，持续治疗2周。模型组及假手术组不做治疗，每次治疗前要对相应穴位及针进行消毒，穴位定位参照《中国兽医针灸学》[11]。

1.3.3 大鼠行为学及运动功能观察 根据盲法原则于每天上午9∶00～11∶00观察各组大鼠的行为变化，包括有无撕咬、烦躁、频繁摇动尾巴、食欲下降、下肢运动障碍、后肢突然抬起等现象。将大鼠放至开阔场地观察其运动功能，请专业人员对其运动功能评分：步态正常记为0分，步态轻度跛行记为1分，后肢无力呈中度跛行记为2分，后肢轻度瘫痪、明显跛行记为3分，分值越高说明运动功能越差。

1.3.4 大鼠机械性痛觉过敏测定 将大鼠置于爪触觉测试仪玻璃箱中，测试之前适应30 min，将电子触觉测量仪对准大鼠的足底部，记录大鼠缩足时电子触觉测量针的刺激力度，记录各组大鼠右后爪治疗前24 h、治疗后24 h的机械刺激缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)。

1.3.5 大鼠热痛觉过敏测定 将大鼠置于足底热刺激仪玻璃箱中，测试之前适应30 min，用热辐射刺激仪照射大鼠足底部的玻璃板，记录从照射开始到大鼠缩足所经历的时间，记为热刺激缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)，最大值为30 s，分别记录各组大鼠右后爪治疗前24 h、治疗后24 h的PWTL值。

1.3.6 取材及材料处理 痛觉实验测定结束后24 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)将大鼠麻醉，经心脏取血3～5 mL，置于特定离心管中，室温静置20 min，4 ℃下3500 r/pm离心10 min，取血清置于-20 ℃冰箱中保存待用。

取10只大鼠的背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)：大鼠麻醉后仰卧，开胸并剪开左心耳，依次用400 mL生理盐水灌洗、400 mL 4%多聚甲醛灌注固定，灌注结束后立即取大鼠右侧L5 DRG，于4%多聚甲醛中固定，4 ℃保存待用。取10只大鼠L2-L3节段剪断后采集脊髓，4 ℃保存待用。

1.3.7 大鼠DRG形态学观察 取1.3.6中DRG经低到高浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后进行切片处理，得到常规病理切片，以二甲苯脱蜡、高浓度到低浓度梯度酒精处理后，使用HE试剂盒染色，具体操作步骤参照说明书进行，经再次脱水、透明后封片于普通光学显微镜中观察。

1.3.8 ELISA法测定大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平 根据ELISA试剂盒中说明书进行血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的测定。

1.3.9 大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相关蛋白表达检测 采用蛋白提取试剂盒提取大鼠L2-L3节段处脊髓中的总蛋白，参照BCA试剂盒说明书要求测定蛋白浓度，8%分离胶及5%浓缩胶进行电泳，湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜上，脱脂奶粉(5%)室温封闭2 h后添加Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β一抗、内参GAPDH(稀释比均为1∶1000)4 ℃孵育过夜，用TBST缓冲液洗涤后添加羊抗鼠二抗(1∶5000)，室温孵育2 h。采用蛋白成像凝胶仪对Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β蛋白水平进行定量分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠行为学及运动功能观察

表1示，假手术组大鼠行为正常，模型组大鼠有轻微烦躁、舔舐后爪、后肢运动障碍等现象，调督组、揿针组、联合组大鼠烦躁、舔舐后爪、后肢运动障碍等现象均得到一定的缓解。与假手术组比较，模型组大鼠运动功能评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，调督组、揿针组、联合组大鼠运动功能评分显著降低(P<0.05)；调督组和揿针组大鼠运动功能评分比较差异无统计学意义(P>0.05)；与调督组和揿针组比较，联合组大鼠运动功能评分降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠运动功能评分比较

2.2 各组大鼠PWMT、PWTL比较

表2示，治疗前24 h与假手术组比较，模型组、调督组、揿针组、联合组大鼠PWMT、PWTL显著降低(P<0.05)。治疗后24 h与模型组比较，调督组、揿针组、联合组大鼠PWMT、PWTL显著升高(P<0.05)；调督组和揿针组大鼠PWMT、PWTL比较差异无统计学意义(P>0.05)；与调督组和揿针组比较，联合组大鼠PWMT、PWTL升高(P<0.05)。与治疗前24 h比较，调督组、揿针组、联合组治疗后PWMT、PWTL显著升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠PWMT、PWTL比较

2.3 各组大鼠DRG组织病理观察

图1示，与假手术组比较，模型组大鼠DRG神经元细胞排列紊乱，呈现明显水肿，核膜模糊、核仁偏移，细胞间隙较大；与模型组比较，调督组、揿针组、联合组大鼠的DRG神经元细胞形态均有一定的改善，其中联合组改善效果较优。

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

表3示，与假手术组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，调督组、揿针组、联合组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)；调督组和揿针组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与调督组和揿针组比较，联合组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

2.5 各组大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相关蛋白表达水平比较

图2表4示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，调督组、揿针组、联合组大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；调督组和揿针组大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与调督组和揿针组比较，联合组大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达水平降低(P<0.05)。

图2 各组大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相关蛋白印迹图

表4 各组大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相关蛋白表达水平比较

3 讨论

LDH致腰腿神经痛是骨科常见的疾病，近年来的发病率呈现逐渐升高趋势，其中以学生、司机等长期采用坐姿的人群患病较多，LDH引起的炎症对于坐骨神经痛的发生具有不利影响[12，13]，因此需要建立更接近临床的动物模型，进一步研究LDH及其引发神经痛的作用机制。程杰[14]等通过自体髓核移植术建立LDH大鼠模型，模型组大鼠的痛阈值显著降低，该方法可较好地诱导大鼠神经行为的改变，与临床接近且对大鼠损伤较小。本研究通过将大鼠尾部髓核移植到L4-L5神经节周围建立大鼠LDH模型，结果显示与假手术组比较，行自体髓核移植术后的LDH模型大鼠有轻微烦躁、舔舐后爪、后肢运动障碍等现象，运动功能评分显著升高，PWMT、PWTL值显著降低，DRG神经元细胞损害严重，与相关研究结果类似，表明移植的髓核对大鼠神经节造成一定的压迫及损害，揭示LDH大鼠模型构建成功。

LDH常会导致坐骨神经痛、神经功能紊乱等，易引发机体的痛觉过敏。资料显示，神经痛主要与神经根机械性压迫、炎症反应等化学性损伤密切相关[15]。Bishop[16]等研究结果显示，LDH患者血清中TNF-α、IL-1β等炎症因子表达水平较高，经过治疗LDH患者的神经痛得到缓解，血清中炎症因子水平呈现下降趋势。调督理筋针法通过调理督脉使机体气血通畅，针刺腰阳关、命门、八髎、肾俞等穴位以调和督脉及理筋通络。牟成林[17]等发现，调督理筋针法对于LDH引起的疼痛具有一定的疗效。揿针疗法是一种埋藏于皮下的新型针灸方法，对于穴位有柔和、持久稳定的刺激，研究发现揿针治疗具有一定的止痛效果，对于LDH所引发的神经疼痛可能具有一定的疗效[18]。本文采用调督理筋针法、揿针疗法二者联合疗法处理LDH大鼠，观察其对大鼠痛觉过敏的影响。结果显示与模型组比较，经过治疗各组大鼠的运动功能评分显著降低，PWMT、PWTL值显著升高，DRG神经元细胞状态得到改善，大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低，其中调督理筋针法与揿针疗法比较差异无统计学意义，二者联合治疗效果最优，表明调督理筋针法及揿针疗法具有降低LDH大鼠血清中炎症因子水平、缓解DRG神经元细胞损伤及LDH大鼠痛觉过敏的作用，但其具体机制尚不清晰，二者联用效果更佳，可能原因是揿针治疗对于腰阳关、命门等穴位的刺激更加持久且稳定，对于筋络的疏通、督脉的调和等方面具有较好的促进作用。

研究发现，Akt/GSK3β通路与大鼠神经病理性疼痛的发生联系密切。GSK3β是Akt的重要反应底物，Akt的磷酸化可导致GSK3β的活化，进而导致机体炎症因子增加[19]。研究发现，抑制GSK3β的活性可显著降低机体内炎症因子的表达及炎症反应的发生[20，21]，对于LDH大鼠引起的疼痛过敏可能具有一定的缓解。本研究结果显示，与模型组比较，各治疗组脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达水平显著降低且联合组最低，表明调督理筋针法及揿针疗法可能是通过调节Akt/GSK3β通路相关蛋白表达来发挥其降低大鼠炎症反应及缓解大鼠痛觉过敏的作用。

综上所述，调督理筋针法、揿针疗法对LDH大鼠所引发的痛觉过敏具有一定的缓解作用，可能通过调节Akt/GSK3β通路相关蛋白表达，降低机体内的炎症反应来实现，但未用相关通路抑制剂进行对比仍需进一步研究。