不同时机电针对卵巢损伤大鼠卵巢储备功能的影响❋

俞舒丹，何 欣,2，史航毓,2，刘志顺△，王伟明△

(1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029)

随着肿瘤及各类慢性病年轻化，女性在育龄期前后接触放化疗及有毒药物，平均80%会出现不同程度的卵巢损伤，严重者甚至卵巢功能完全衰竭，极大地影响女性生育健康[1，2]。针对有生育意愿但未来需承担卵巢损伤风险的女性，2007年Woodruff[3]提出了肿瘤生殖学，这是一项肿瘤学与生殖医学交叉整合的新型学术领域，目的是在保证原发肿瘤治疗的前提下，更加有效地保护肿瘤患者的生育力，实现延长生命和保存生育能力之间的平衡。为保护女性卵巢储备功能、保存生育力，欧洲ESHRE发布的女性生育力保护指南提出可以在女性生育力未损伤前预处理使用卵泡、胚胎等冻存技术，或使用促性腺激素释放激素类似物(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRHa)等保护剂，减缓卵巢衰竭和损伤[4]。根据国内外研究，已经有相关人群采用以上生殖保护措施获得了正常生育[5，6]。然而，以上保护卵巢储备功能的方案仍存在一定局限，如胚胎冻存技术费用昂贵，且不适用于无男性伴侣者；乳腺癌患者GnRHa若联合内分泌治疗或长期使用，反而可能成为卵巢功能不全的危险因素等[7，8]。

有研究和前期实验表明，中药或针灸针对卵巢储备功能减退的治疗机制为抑制卵巢颗粒细胞凋亡，实现对卵泡池中窦卵泡的保护效应[9-11]。然而，在造模前进行电针预处理是否具有更好的卵巢功能保护效应，尚属未知。本实验拟通过构建去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)诱导的大鼠卵巢功能损伤模型，观察不同时机电针对卵巢损伤大鼠卵巢储备功能的影响，探讨其可能的差异化保护机制。本研究通过中国中医科学院广安门医院伦理委员会标准。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级10～12周龄健康SD雌性大鼠40只，体质量(230±20) g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(京)2012-0001。大鼠购回后适应性喂养3 d，同时连续观察大鼠动情周期10 d，选取动情周期规则的32只大鼠按随机数字表法分空白组、模型组、模前组(造模前电针组)、模中组(造模中电针组)4组各8只。

1.2 主要试剂与仪器

去氧乙烯基环己烯(西格玛生物科技有限公司，4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD，货号94956)；抗缪勒氏管激素(anti-müllieus hormones,AMH)Elisa 试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E11162r)；AMH 蛋白抗体(货号Ab24542)、促性腺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)放免试剂盒(北京华英生物技术研究所，货号HY-10024T)；超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)、逆转录试剂盒(货号CW0744M)、一步法荧光定量PCR专用试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0659)；荧光定量PCR上下游引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；异氟烷(鲁南贝特制药有限公司，货号26675-46-7)。

BX41光学显微镜，日本奥林巴斯有限公司；MULTISKANMK3全自动多功能酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；γ-911放射免疫计数器，中国科技大学实业总公司；ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；SDZ-V型电针治疗仪、0.3 mm×25 mm一次性华佗牌无菌针灸针，中国苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 模型制备

参考Muhammad[12]报道方法，每日腹腔注射VCD 160 mg/kg，连续15 d(具体以芝麻油配液，2.5 μg/g 体质量，每次注射体积不超过0.4 mL)。从腹腔注射第1天开始，根据Cora MC[13]方法每天上午8点观察大鼠阴道涂片，若大鼠阴道涂片显示动情间期明显延长(≥6 d)或超过2个周期无性周期变化，则提示动情周期紊乱造模成功。

1.4 干预方法

按以上方法造模，模前组先连续进行4周的电针预处理,然后进行造模给药；模中组是在造模用药的第1天即开始进行电针处理，连续电针干预4周。根据前期实验经验[11]，2个电针组治疗频率均为前2周5次/周，后2周3次/周。具体操作方法为将大鼠捆绑置于特制鼠袋中，用胶带黏贴在操作台上，根据《实验针灸学》《实用动物针灸手册》确定穴位，隔次交替选择中髎穴(双侧，第2骶后孔)和天枢穴(双侧，第4对乳头平齐腹白线旁开2 mm)进行穴位定位[14，15]。中髎穴毫针直刺7～10 mm，天枢穴毫针直刺3～5 mm，针柄连接电针治疗仪调连续波，电流0.1～1 mA，频率1～3 Hz，时间20 min。空白组正常饲养，模型组正常造模且无电针干预。

1.5 取材方法

模型组全部大鼠造模成功后监测各组大鼠阴道涂片，在所有大鼠阴道涂片显示动情间期24 h内取材，所有大鼠取材前禁食(不禁水)12 h，于次日麻醉放血处死大鼠(1.8%异氟烷气体麻醉维持)。各组大鼠腹主动脉取血4～5 mL保存至采血管中。使用消毒后的眼科镊小心剥离脂肪组织与系膜，分离大鼠左右侧卵巢，左侧卵巢置于4%多聚甲醛溶液中固定，右侧卵巢液氮冻存。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 卵巢组织形态和各级卵泡数量 经石蜡包埋各组大鼠左侧卵巢组织，横切卵巢断面厚度约为5 μm，组织切片经苏木精-伊红染色后，中性树脂胶封。光学显微镜在10×物镜下观察，拍照计数原始、初级、次级和闭锁卵泡数量，Image Pro Plus 6.0软件处理并对图片进行分析。

1.6.2 血清性激素水平 检测各组大鼠血清AMH、FSH水平，分别按照ELISA试剂盒、放免试剂盒说明书进行操作。

1.6.3 卵巢组织AMH蛋白检测 提取各组大鼠右侧卵巢组织蛋白，测定浓度后用12%的分离胶电泳分离蛋白并以湿法转膜80 min，以5%脱脂奶粉常温封闭PVDF膜100 min后，先后加入AMH一抗(浓度1∶1000)和二抗(山羊抗鼠，浓度1∶10000)孵育，TBST洗膜，ECL发光取片，β-actin为内参照。

1.6.4 卵巢组织AMH mRNA表达检测 Trizol法提取各组大鼠右侧卵巢总RNA测定浓度，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。反应条件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 40 min，70 ℃ 10 min。将内参、目的基因上下游引物、各组样品、SYBR Green PCR Mixture、ddH2O依次加入96孔板中进行扩增，反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 60 s，45个循环。2-ΔΔCT法计算AMH mRNA的相对表达量(引物序列见表1)。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 造模情况

模型组与模中组在造模过程中各有1只大鼠死亡。注射VCD造模后14 d，模型组与模前组动情周期基本正常，模中组动情周期全部紊乱。初次使用VCD造模后70 d，模型组所有大鼠阴道涂片均显示造模成功，模前组、模中组造模成功率分别为100%、85.7%(6/7)。

2.2 卵巢组织形态和各级卵泡数量

2.2.1 卵巢组织形态 图1示，大体形态方面空白组大鼠卵巢体态饱满，周围满布细小颗粒；模型组、模前组、模中组大鼠卵巢萎缩，模型组可见颗粒明显疏松。显微镜下可见，与空白组比较，模型组卵巢组织原始卵泡明显减少，次级卵泡结构破坏且排列松散，成熟卵泡较少，闭锁卵泡及间质腺明显增加，局部可见大量炎性细胞浸润。模前组较模型组卵巢损伤程度轻，原始卵泡、初级卵泡和成熟卵泡数稍多于模型组，卵泡周边颗粒细胞层相对完整，卵泡液充实完整。模中组与模型组比较，原始卵泡、初级卵泡数差别不明显，局部可见大量闭锁卵泡和少量炎性细胞浸润。

图1 HE 染色检测各组大鼠卵巢组织病理学变化(×100)

2.2.2 卵巢各级卵泡数量 表2示，与空白组比较，模型组左侧卵巢组织切片中原始卵泡、初级卵泡明显减少，闭锁卵泡明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，模前组大鼠左侧卵巢组织切片中原始卵泡、初级卵泡明显增加，闭锁卵泡明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 大鼠卵巢组织中各级卵泡数目比较

2.3 血清性激素水平

表3示，与空白组比较，模型组血清AMH降低、FSH升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，模前组和模中组血清AMH升高、血清FSH降低，差异有统计学意义(均P<0.05)；模中组血清AMH高于模前组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清AMH、FSH水平比较

2.4 卵巢组织中AMH蛋白含量

图2表4示，与空白组比较，模型组卵巢组织AMH蛋白表达灰度值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，模前组、模中组大鼠卵巢组织AMH蛋白含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：抗缪勒氏管激素(Anti--Müllieus Hormones,AMH)图2 各组卵巢组织AMH蛋白含量比较

表4 各组卵巢组织AMH蛋白灰度值分析比较

2.5 卵巢组织中AMH mRNA相对表达量

表5示，与空白组比较，模型组卵巢组织AMH mRNA相对表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，模前组、模中组大鼠卵巢组织AMH mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 大鼠卵巢组织AMH mRNA表达情况比较

3 讨论

卵巢储备功能是目前生殖医学的常用术语，包括生育能力和内分泌功能，然而迄今为止有关卵巢储备功能的检查存在局限，尚无囊括原始卵泡数量和功能的单一检测手段，目前公认以AMH，窦卵泡数(antra1 follicle count,AFC)和FSH综合评估卵巢储备功能[16]。AMH是一种由原始卵泡和窦前小卵泡颗粒细胞分泌的转化因子β超家族成员，主要通过AMH受体II(AMH receptor II，ANHR II)发挥抑制原始卵泡招募的生物学作用。因此有研究以AMH作为抑制小鼠原始卵泡激活，防止环磷酰胺、铂类等毒性化学药物损伤卵巢的保护剂[17]。大量比较实验发现，AMH数值相对稳定，不随环境和月经周期波动，因其数值的大小可以近似代表卵巢储备功能，其在预测卵巢损伤和卵巢寿命、衡量卵巢刺激方案效力等方面具有不可替代的优势[18，19]。

卵巢损伤属于中医学“月经失调、闭经、不孕”范畴。《素问·阴阳别论篇》中有关于月经的著名论述“二阳之病在心脾，有不得隐曲，女子不月”。“二阳”目前公认指手足阳明经，阳明为多气多血之经，病在阳明，针以引气调动阳明经气血回归胞宫，调经助孕。本研究基于刘志顺临床经验选择双侧中髎穴与天枢穴，一方面二穴临近病位，另一方面二穴归属足太阳膀胱经和足阳明胃经，深刺引阳入阴，强力疏通气血[20]。现代研究表明，针刺还可以抑制下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPO)，下调FSH水平，发挥上源性神经化学调节作用[21]。除中枢性机制外，针刺还能通过刺激外周神经血管调控局部，如改善受刺激卵巢局部的血液循环，增加细胞因子的分泌等[22]。本研究基于韩济生[23]团队的研究，发现2 Hz低频电流对卵泡的生长有帮助作用。前期动物实验也证实，低频电流下针刺对卵巢激素水平调节效果显著[11]。本研究结果证实，造模前电针预处理联合2 Hz低频电流在调控原始卵泡发育和抑制成熟卵泡闭锁中有一定疗效。

本研究证实，160 mg/kg可以成功复制卵巢原始卵泡损伤模型，文献报道VCD有特异性卵巢毒性，能够通过加速原始卵泡到初级卵泡的募集，降低AMH表达水平[24]。研究观察了电针调控对VCD所致卵巢损伤大鼠卵巢结构与功能的影响。本研究模前组在增加窦卵泡数量方面明显优于模中组，可能是由于卵巢未损伤前电针能够抑制原始卵泡发育，减轻VCD特异性损伤，稳定AMH基因转录表达，从而发挥出保护卵巢储备功能的作用。通过发病前电针预处理(模前组)与发病中电针处理(模中组)证实，2个电针组均能升高血清AMH水平、卵巢AMH蛋白和mRNA表达，证实电针可以稳定损伤卵巢的颗粒细胞活性，改善卵巢储备功能。这与一项针灸对卵巢功能不全的系统评价结论一致[25]。金洵[26]在艾灸干预对卵巢储备功能低下的影响研究中发现，先于疾病的预防性干预优于疾病发生后的治疗。综上本研究证实，发病前与发病过程中电针处理均可在一定程度减轻卵巢损伤。从造模第1天到第70天造模成功，课题组发现大鼠卵巢损伤随时间进展逐渐加重，尽管电针无法逆转卵泡与颗粒细胞递进式的损伤趋势，但阴道涂片监测动情周期的结果显示，电针预处理很可能存在一定的远期维持效应。未来可以生育力为切入点，展开电针预处理对卵巢储备功能近远期疗效与机制的研究。

笔者实验前的假说预测模前组电针预处理对卵巢储备功能的保护优于模中组电针处理，然而本实验中2个电针组在卵巢AMH蛋白和mRNA的结果上并没有出现明显差异，分析原因一是可能造模药物本身剂量对卵巢的损伤程度较重，部分大鼠存在腹腔黏连甚至死亡，实验过程中较多原始卵泡、初级卵泡坏死，因而模中组的电针干预保护不及；二是可能设置造模成功的时点较晚，VCD对卵巢的损伤已累积且实验动物数量较少，因而可能未充分显示出2组间的保护差异。未来实验需进一步探索不同程度卵巢损伤与VCD给药剂量和时长的关系，此外仍需对针刺保护卵巢功能调控相关通路进行研究。

综上所述，造模前或造模中电针“中髎/天枢”对卵巢损伤大鼠卵巢储备功能可能均有一定保护作用。造模前电针“中髎/天枢”可能通过抑制卵泡发育、稳定AMH基因转录与蛋白表达发挥保护卵巢储备功能的作用。