色氨酸-2,3-双加氧酶2上调介导犬尿氨酸代谢在大鼠佐剂性关节炎中的作用研究

贾成艳，韩 萍，王越业，许 媛，许和鹏，陈阿圆，魏 伟，常 艳

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种系统性自身免疫病，临床表现主要为慢性滑膜炎症和关节软骨、骨损伤[1]。早在20世纪学者们就发现RA患者血清、尿液和关节滑液中色氨酸(tryptophan,Trp)-犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)代谢产物水平升高[2]，RA动物模型实验同样验证了类似的结果[3]，提示Trp-Kyn代谢可能参与RA发生发展和病理机制。

吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)1、IDO2 和色氨酸-2,3-双加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase 2,TDO2)是Kyn途径的3个重要限速酶，但三者具有底物特异性和表达特异性。IDO1广泛表达于各个组织和细胞，其在RA中的作用存在争议，既表现为抗炎作用[4-5]，也表现为促炎作用[6]。IDO2与IDO1具有高度同源性，近年来发现IDO2可促进自身抗体产生，参与自身免疫性关节炎发生发展[7]。TDO2主要表达于肝脏，在多种肿瘤组织中表达较高，其在自身免疫病中研究较少。近年来研究发现TDO2可能是多发性硬化症等自身免疫病的潜在治疗靶点[8]。然而TDO2介导的Kyn代谢途径在RA病程不同阶段的表达及活性尚不明确。该研究探讨佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠炎症不同阶段Trp和Kyn水平变化以及TDO2表达特点，为初步探索TDO2介导的Kyn代谢通路参与RA病理机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 6～8周SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(150±20)g，合格证号：SCXK(皖)2017-001，购于安徽医科大学实验动物中心。大鼠在 SPF 级实验室、湿度(50±10)%及温度(24±2)℃下饲养。本课题由安徽医科大学临床药理研究所动物研究伦理委员会批准，实验中相关方法均根据动物实验相关指南和法规进行。

1.1.2试剂 卡介苗(bacillus calmette-cuerin,BCG)购于新华群硕实验用品销售部；L-Trp(WXBC4097V)购于美国Sigma公司；L-Kyn(BCBT1074)购于美国Sigma公司；TDO2(15880-I-AP)抗体购于美国Proteintech公司；DAB显色试剂盒(ZLI-9018)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器 YLS-7A 足趾容积测量仪购于山东医学科学院；BX53 正置显微镜购于日本Olympus 光学工业株氏会社；Agilent1200 高效液相色谱仪购于美国Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1AA大鼠模型建立 BCG(50 mg)置于80 ℃水浴灭活1 h，与5 ml无菌液体石蜡混匀，研磨充分并用注射器抽打至乳白色，制成完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)。大鼠右后趾皮内注射0.1 ml CFA致炎，正常组注射生理盐水作为对照，造模当天认定为d0。

1.2.2AA大鼠整体指标 ① 大鼠足爪肿胀度：造模前测量继发侧后足(左后足)容积，d14起，每3 d测量一次。继发侧足爪肿胀度=致炎后足爪容积-致炎前足爪容积。② 关节肿胀数评分(每只大鼠最高24 分)：自d14起，每3 d记录关节肿胀数。每只足爪计1个踝关节(或腕关节)和5个指(趾)关节，每个关节肿胀记1分。③ 全身评分(每只大鼠最高8分)：自d14起，每3 d进行全身表现评分。耳、鼻、尾出现红肿或结缔组织肿胀记1分；每只前(后)足爪肿胀记1分。④ 体质量：自d14起，每3 d称量体质量并记录。

1.2.3肝脏和关节滑膜病理学观察 大鼠处死后，分离肝脏和膝关节，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，膝关节使用EDTA 脱钙液进行慢脱钙(肝脏无需脱钙)，石蜡包埋，制作厚约5 μm的组织切片，经苏木精-伊红(HE)染色后，显微镜下观察。

1.2.4免疫组化检测肝脏和关节滑膜TDO2表达 大鼠肝脏和滑膜组织切片常规处理，4 ℃过夜孵育TDO2抗体，次日室温孵育二抗2 h，DAB显色后苏木精复染，封片后显微镜下观察组织TDO2表达情况。将免疫组化染色强度分为以下4类：0分，细胞无着色；1分，细胞着色为淡黄色；2分，细胞着色为棕色；3分，细胞着色为深棕色。同时将阳性细胞百分比分值分为以下 5类： 0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞≤20%；2分，20%<阳性细胞≤50%；3分，50%<阳性细胞≤75%；4分，阳性细胞>75%。最终将染色强度分值与阳性细胞百分比分值相乘得出评分结果[9]。

1.2.5HPLC检测血清和肝脏组织匀浆上清液Trp、Kyn含量

1.2.5.1 标准曲线建立 血清和肝脏组织匀浆上清液装入500分子量透析袋，在Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液透析2～3 d并及时更换透析液，直至透析液澄清，透析出低于500分子量的小分子物质，得到不含Trp(分子量204.23)和Kyn(分子量208.21)的空白样品。向空白样品中加入1 000 μmol/L Kyn标准品，梯度稀释，使Kyn浓度分别为20、10、5、2、1、0.5 μmol/L，同时加入20 000 μmol/L Trp标准品，梯度稀释，使Trp浓度分别为1 000、500、250、100、50、25 μmol/L。样品加入等体积5%高氯酸沉淀蛋白，充分震荡后14 000 r/min 高速离心 10 min，取20 μl上清液进样分析[10]。由峰面积和标准品浓度计算得到标准曲线。

1.2.5.2 样品前处理 取血清和肝脏组织匀浆上清液100 μl并加入等体积5%高氯酸沉淀蛋白，充分震荡静置后14 000 r/min 离心 10 min，取20 μl上清液进样分析[10]。所得峰面积经标准曲线计算样品Kyn、Trp浓度。TDO2为肝脏中Trp主要代谢酶，肝脏中Kyn/Trp比值可用于衡量TDO2活性[11]。

1.2.5.3 色谱柱条件 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×5 mm,5 μm)；流动相为乙腈 ∶醋酸钠(8 ∶92)；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；Trp紫外检测波长：280 nm，出峰时间约9 min；Kyn紫外检测波长：360 nm，出峰时间约6 min[10]。

2 结果

2.1 AA大鼠整体指标观察CFA免疫后d15～18炎症初期，AA大鼠耳朵、鼻、尾巴、前爪及后足趾踝关节出现红肿，体质量开始减轻。d19～27为炎症高峰期，AA大鼠耳朵、鼻和尾部出现大面积红肿结节，继发侧踝关节(左后足趾)表现为持续性肿胀。d27之后为炎症缓解期，AA大鼠全身炎症逐渐减轻(图1)。

2.2 AA大鼠炎症不同阶段关节滑膜和肝脏组织病理学变化正常组大鼠关节结构完整且表面光滑，2～3层滑膜细胞覆盖于软骨外侧。AA大鼠炎症初期滑膜细胞增生，关节滑膜内有少量炎性细胞浸润；高峰期AA大鼠关节黏连，滑膜细胞增生为多层并伴有大量炎性细胞浸润，形成丰富的血管翳，关节软骨受到侵蚀；与高峰期比较，缓解期关节滑膜内炎性细胞浸润减少(图2A1～4)。

正常组大鼠肝细胞形态正常，肝小叶结构完整；AA大鼠炎症初期表现为肝索紊乱，胞质疏松，胆管周围存在少量淋巴细胞浸润；炎症高峰期肝细胞病理变化较明显，且胆管周围存在大量淋巴细胞浸润；炎症缓解期淋巴细胞浸润减少(图2B1～4)。

图2 不同炎症阶段AA大鼠关节滑膜和肝脏病理变化 HE×100

2.3 AA大鼠炎症不同阶段关节滑膜和肝脏组织TDO2表达免疫组化及其评分结果显示，正常组和初期AA大鼠滑膜和肝脏组织中TDO2表达较低。与正常组比较，高峰期(F=16.418,P<0.01)和缓解期(F=16.418,P<0.05)大鼠关节滑膜TDO2表达升高；高峰期(F=27.686,P<0.01)和缓解期(F=27.686,P<0.05)大鼠肝脏组织中TDO2表达升高(图3)。

图3 不同炎症阶段AA大鼠关节滑膜和肝脏组织中TDO2表达变化 DAB×100

2.4 AA大鼠炎症不同阶段血清和肝脏组织匀浆上清液中Trp和Kyn水平变化HPLC检测血清(表1)和肝脏组织匀浆上清液(表2)中Trp和Kyn含量。与正常组比较，初期、高峰期和缓解期AA大鼠血清中Trp水平均降低(F=91.397,P<0.01)，且缓解期与初期、高峰期之间的差异有统计学意义(F=91.397,P<0.05)；初期AA大鼠血清中Kyn水平升高(F=26.577,P<0.01)。与正常组比较，初期AA大鼠血清中Kyn/Trp比值(即TDO2活性)升高(F=50.227,P<0.01)(图4A)。

表1 不同炎症阶段AA大鼠血清中Trp和Kyn含量

表2 不同炎症阶段AA大鼠肝脏中Trp和Kyn含量

与正常组比较，高峰期(F=13.661,P<0.01)和缓解期(F=13.661,P<0.05)AA大鼠肝脏组织Trp水平降低，且两者之间的差异有统计学意义(F=13.661,P<0.05)；初期、高峰期、缓解期AA大鼠肝脏组织Kyn水平升高(F=2.766,P<0.01)，高峰期、缓解期与初期比较，差异有统计学意义(F=2.766,P<0.05)。与正常组比较，高峰期(F=23.452,P<0.01)和缓解期(F=23.452,P<0.05)AA大鼠肝脏组织中Kyn/Trp比值(即TDO2活性)升高(图4B)。

图4 不同炎症阶段AA大鼠血清和肝脏Kyn/Trp比值变化

3 讨论

随着代谢组学的研究与发展，学者们提出细胞代谢异常可能介导了RA的发生和发展[12]。RA患者Trp-Kyn代谢异常活化，其3个重要限速酶可能是重要的治疗靶点。由于IDO1、IDO2、TDO2功能特异性，调控机制复杂，在不同细胞或疾病中作用机制可能存在差异或相互影响，而TDO2在RA中的作用未见报道，因此探究TDO2介导的Kyn代谢通路在RA不同炎症阶段变化和特点，初步阐明 TDO2 在RA病理机制中的作用尤为重要。

本研究建立了AA模型，模型大鼠足爪肿胀度、全身评分和足爪肿胀数等整体指标明显改变，膝关节滑膜组织异常增生、大量炎性细胞浸润，形成丰富的血管翳，与RA表现出相似的病理学变化，提示模型制备成功。超过一半的RA患者可能伴有肝酶升高、肝脏组织学异常，包括慢性炎性细胞浸润、肝细胞坏死等病理学变化[13]。本研究发现AA大鼠肝脏出现异常病理学变化，主要表现为肝索紊乱，肝细胞胞质疏松，炎性细胞浸润，且从炎症早期即出现病理学变化，高峰期表现明显。因此，在疾病早期认识肝脏损害，并根据损害的性质采取适当的治疗，可能具有重要的临床意义。

本研究进行了AA模型不同炎症阶段(初期、高峰期、缓解期)TDO2表达及其介导的Kyn代谢变化研究，结果显示，炎症高峰期和缓解期关节滑膜中TDO2表达异常升高(P<0.05)，提示TDO2可能参与AA大鼠滑膜炎症发生发展。同时发现AA大鼠炎症高峰期和缓解期肝脏中TDO2表达增加(P<0.05)，提示TDO2可能参与肝脏Kyn代谢及异常病理学变化。

HPLC结果显示AA大鼠血清Trp水平降低(P<0.01)，与文献报道一致[5]。此外，本研究首次在AA大鼠模型中检测肝脏组织中Trp-Kyn代谢变化，结果显示，炎症高峰期AA大鼠肝脏组织中Kyn/Trp比值(即TDO2活性)升高(P<0.01)，提示TDO2介导的Kyn代谢在炎症高峰期高度活化。肝脏中异常活化的Trp-TDO2-Kyn代谢如何影响关节滑膜炎症呢？可能是TDO2表达和活性的增加，导致系统Kyn大量积累，Kyn可作用于FLS表面芳香烃受体，激活的芳香烃受体可诱导FLS异常活化，促进FLS增殖、迁移以及分泌炎性细胞因子IL-1β和IL-6，参与关节滑膜炎症和关节破坏[14]。

综上所述，Kyn代谢异常可能参与了AA发生发展，其重要限速酶TDO2在AA高峰期异常表达和活化，可能介导了AA大鼠的发生发展及异常病理学变化，为阐明RA 新的病理机制和发现新的药物靶点提供重要依据。