植物乳杆菌发酵笋壳的营养物质和可培养芽孢杆菌动态变化研究

刘 欣，阮传清，郑雪芳，肖荣凤，陈 峥，刘 波，王阶平

(福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福建 福州 350003)

我国是产竹大国，纯竹林面积420万hm2，其中食用笋竹点竹林总面积69.39%，年产值约450亿元以上[1]。竹笋栽培及竹产业已成为福建、浙江、江西等产竹大省的新经济增长点。笋壳是各种竹笋加工过程中的废弃物，年产量可达15.7亿kg[2]，大规模丢弃的笋壳极易腐烂，造成严重的污染威胁[3]。笋壳富含动物必需的微量元素和多种功能性物质，对动物机体具有重要的生理活性作用[4]。鲜笋壳的中性洗涤纤维与缓冲能含量显著高于草粉和麦麸[5]。但笋壳适口性差，且生笋壳中含有氰甙，当细胞结构破裂时，植物内的葡萄糖苷酶水解氰甙生成剧毒的氢氰酸[6-7]。通过微生物发酵，不仅可以降解笋壳的大分子物质，促进动物营养吸收，而且可以降低其氰甙含量，提高笋壳适口性，使笋壳成为优质家畜饲料的原料来源[5]。王音等利用霉菌、芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌混合发酵笋壳生产动物饲料，提高了饲料中粗蛋白含量[8]。梁磊等利用不同食药用菌对竹笋壳进行固态发酵，发现食药用菌发酵后笋壳纤维结构被严重破坏，粗蛋白质和多糖含量显著提高，总黄酮含量有所降低[9]。郑锐东等构建了黑曲霉固态发酵笋壳动力学模型，能够反映黑曲霉固态发酵笋壳过程[10]。有关笋壳发酵饲料的研究仍较少，笋壳发酵过程中微生物群落及营养组成的演变过程尚未见系统的研究报道。芽孢杆菌具有抗逆性强、易培养、耐贮藏、加工损失少的优点，常被筛选为发酵饲料的发酵菌剂[11]。本研究采用分离培养的方法，观察乳酸菌发酵笋壳过程中，可培养芽孢杆菌种群动态与发酵物COD、总氮的变化，以了解探笋壳发酵规律，为筛选笋壳发酵菌剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 笋壳发酵样品采集

利用福建省永春县清水笋加工厂产生的笋壳开展发酵试验。笋壳从清水煮熟的毛竹笋剥离下来，并机械粉碎。发酵试验在田间盖膜堆垛形式进行。试验分2组，每组5 t笋壳，置于田间发酵坑(长2.5 m×宽2.0 m×高1.0 m)；第1组为处理组(TR-接种发酵组)，接种含菌浓度为108cfu·g-1植物乳杆菌菌剂150 kg(即接菌量3%)，与笋壳拌匀，堆体湿度调整到50%～60%；第2组为对照组(CK-自然发酵组)，不接种微生物菌剂，湿度调整到50%～60%；盖上薄膜进行发酵。处理组和对照组于发酵5、10、15 d分别取样，共取得试验样品6个，放至于-20℃冰箱保存备用。

1.2 笋壳发酵过程中物料总氮和COD的检测

将不同发酵时间、不同处理笋壳发酵物料样品配置成10%的水溶液，在25℃浸提1 h后，离心取上清液，稀释200倍用于测定总氮(TN)和化学需氧量(COD)，指示可溶性有机碳化合物含量，重复3次，并以清水作对照。测定在水质分析仪(日本TOADK)上进行。测定时，将稀释液依次放入检测瓶中，仪器检测总氮(TN)检测方法为碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，COD(化学需氧量)检测方法为高锰酸钾法。将测定结果构建数据矩阵，以总氮和COD为指标，发酵时间为样本，马氏距离为尺度，用可变类平均法进行系统聚类分析。

1.3 笋壳发酵过程可培养芽孢杆菌的分离

称取10 g笋壳发酵样品加入到90 mL的无菌水中，再将其放入30℃、180 r·min-1的摇床中振荡30 min，充分混匀，之后将其放置在80℃的水浴锅中温育10 min，杀死非芽孢杆菌。10倍梯度系列稀释后，涂布NA平板，30℃培养2 d，统计样本芽孢杆菌含量。分离的芽孢杆菌纯化后，用20%甘油、-80℃超低温冰箱保存，同时将纯化的菌株进行16S rDNA序列分析。

1.4 笋壳发酵过程可培养芽孢杆菌的16S rDNA鉴定

按细菌基因组提取试剂盒(generary bitehch，美国)操作步骤提取分离到的芽孢杆菌的基因组DNA，采用16S rRNA通用引物27 F和1492 R进行PCR扩增。PCR反应程序为94℃预变性4 min；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃复性1 min，重复35个循环，最后72℃下延伸10 min。PCR产物送至上海博尚测序，应用NCBI Blastn完成序列同源性比对。

2 结果与分析

2.1 笋壳发酵过程中物料的总氮(TN)和化学需氧量(COD)变化动态

2.1.1笋壳发酵过程中物料的TN变化 从总氮含量变化看，自然发酵过程中(初期5 d、中期10 d、后期15 d)，笋壳样品总氮含量分别为0.20 mg·L-1、3.73 mg·L-1、2.32 mg·L-1，呈初期低、中期高、后期低的变化动态(图1A)；而接种植物乳杆菌发酵过程中，总氮含量随着发酵进程显著增加(P<0.05)，笋壳样品总氮含量由初期的1.48 mg·L-1增加到中期的2.49 mg·L-1，后期达到高峰，为4.88 mg·L-1；研究发现，自然发酵组总氮含量峰值在中期，接菌发酵峰值在后期，且发酵后期接菌发酵组总氮含量显著高于自然发酵组，表明接菌发酵提升了笋壳中微生物的氮代谢活性。

2.1.2笋壳发酵过程中物料的COD变化 从COD含量变化看，自然发酵与接菌发酵过程中，随着发酵时间的增加物料COD含量也增加，接菌发酵COD含量增加水平高于自然发酵；表明接菌发酵促进了笋壳中微生物的COD代谢活性(图1B)。

图1 笋壳发酵过程总氮量、化学需氧量及二者比值的变化 Fig.1 Changes of total nitrogen, chemical oxygen demand and their ratio during the fermentation process of bamboo shoot shell

2.1.3笋壳发酵过程物料的COD/N变化 从COD/N比变化看，COD为化学需氧量，主要成分为含碳有机物，COD/N比代表着碳氮比的变化趋势；自然发酵过程中COD/N值逐渐下降，由发酵初期的179.01下降到发酵后期的12.79；接菌发酵过程中COD/N比值稳定在36.78～38.52之间，这与接菌发酵增加总氮含量的同时同步增加COD相关(图1C)。

2.2 笋壳发酵过程中可培养芽孢杆菌分离与鉴定

从6个笋壳发酵样品中共分离得到12株芽孢杆菌，经16S rDNA序列分析，为5个芽孢杆菌属9个种，分别为芽孢杆菌属Bacillus的暹罗芽孢杆菌Bacillussiamensis、蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus、环状芽孢杆菌Bacilluscirculans、贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis和高地芽孢杆菌Bacillusaltitudinis；新芽孢杆菌属Neobacillus的土壤新芽孢杆菌Neobacillussoli；赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus的细长赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillusmacroides；类芽孢杆菌属Paenibacillus的饲料类芽孢杆菌Paenibacilluspabuli；鲁梅尔芽胞杆菌属Rummeliibacillus司氏鲁梅尔芽胞杆菌Rummeliibacillusstabekisii(表1)。

表1 笋壳发酵过程芽孢杆菌种类的分离与鉴定

2.3 笋壳发酵过程中可培养芽孢杆菌菌群变化

从笋壳发酵过程中可培养芽孢杆菌种类(图2)可知，自然发酵组初期(5 d)主要种群为暹罗芽孢杆菌，含量为6×107cfu·g-1；中期(10 d)主要种群为细长赖氨酸芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌，含量分别为6×107cfu·g-1和2×107cfu·g-1；后期(15 d)主要种群为高地芽胞杆菌、司氏鲁梅尔芽胞杆菌和饲料类芽孢杆菌，含量分别为5×107、7×107、7×107cfu·g-1。接菌发酵组初期主要种群为暹罗芽孢杆菌(3×107cfu·g-1)、蜡样芽孢杆菌(2×107cfu·g-1)和环状芽孢杆菌(3×107cfu·g-1)；中期主要种群为暹罗芽孢杆菌(2×108cfu·g-1)和赫伯斯滕副芽孢杆菌(6×107cfu·g-1)；后期主要种群为暹罗芽孢杆菌(6.5×108cfu·g-1)和贝莱斯芽孢杆菌(8×107cfu·g-1)。

图2 笋壳发酵过程不同处理组芽孢杆菌数量变化 Fig.2 Changes of the number of Bacillus in different treatment groups during the fermentation process of bamboo shoot shell

笋壳自然发酵组可培养芽孢杆菌数量总和(3.3×108cfu·g-1)显著低于接菌发酵组数量总和(5.5×108cfu·g-1)。发酵初期(5 d)，自然发酵组芽孢杆菌数量总和(6×107cfu·g-1)与接菌发酵组(8×107cfu·g-1)相近；发酵中期(10 d)，接菌发酵组芽孢杆菌数量是自然发酵组的3.25倍；发酵后期(15 d)，接菌发酵组芽孢杆菌数量是自然发酵组的3.84倍；表明笋壳接菌发酵能促进可培养芽孢杆菌种群数量的增长(图2)。

2.4 芽孢杆菌种群与物料生化物质相关性分析

笋壳发酵过程中芽孢杆菌种群与物料生化物质相关性分析结果见表2。笋壳发酵过程芽孢杆菌数量与总氮TN和有机碳化合物COD含量呈正相关，相关系数分别为0.712 4和0.973 3，与COD含量呈极显著正相关(P<0.01)，与碳氮比COD/TN呈负相关，但相关性不显著。表明笋壳发酵过程有机碳化合物含量的变化影响芽孢杆菌数量变化，有机碳化合物含量越高，芽孢杆菌数量越高。

表2 笋壳发酵过程中芽孢杆菌种群与生物量的相关系数

2.5 基于芽孢杆菌种群与物料生化物质含量变化的笋壳发酵过程聚类分析

以不同处理和发酵时间的笋壳为样本，芽孢杆菌分布数量和生化物质含量为指标，马氏距离为尺度，用类平均法进行系统聚类。结果表明，根据芽孢杆菌和生物物质含量，可将笋壳发酵过程分为两组(图3)，第一组为自然发酵组，特征为有机碳化合物COD(平均值41.51 mg·L-1)和芽孢杆菌数量低(平均值1.1×108cfu·g-1)；第二组为接菌发酵组，特征为有机碳化合物COD(平均值100.41 mg·L-1)和芽孢杆菌数量高(平均值3.6×108cfu·g-1)。表明接种发酵组在微生物作用下能够分解出较多有机碳化合物。

图3 基于笋壳发酵过程芽孢杆菌种群与生化物质含量变化的聚类分析Fig.3 Cluster analysis on the population and biochemical substance content changes of Bacillus during the fermentation process of bamboo shoot shell

3 讨论与结论

本研究将不同处理、不同发酵时间的笋壳发酵物料配置成10%的水溶液，在25℃浸提1 h后，离心取上清液，稀释200倍用于测定总氮(TN)和化学需氧量(COD)，由此可以比较2组处理中微生物对有机物的降解能力的差异。接种发酵组产生的有机碳化合物含量(即COD)比自然发酵组高出2.42倍，总氮(TN)含量增加了41.6%，表明接种乳酸菌后增强了微生物分解有机碳化合物的能力和氮代谢活性。王赫等研究表明，乳酸菌发酵饲料粗蛋白、氨基酸、非植酸磷等营养物质含量显著高于未发酵饲料[12]。混合乳酸菌对笋壳进行青贮发酵，显著增加发酵产物的粗蛋白等营养含量[13]。

在本研究中，笋壳添加乳酸菌发酵，其物料中的可培养芽孢杆菌数量显著高于自然发酵组。乳酸菌能产生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶，促进各种大分子营养物质的分解，从而有利于其他微生物的生长[12]。笋壳发酵过程中是否添加乳酸菌对芽孢杆菌种群的演替影响不同。例如，发酵初期暹罗芽孢杆菌均为接菌发酵组和自然发酵组的优势种；发酵后期暹罗芽孢杆菌仍为接菌发酵组的优势种，但不是自然发酵组的优势种。关于暹罗芽孢杆菌研究有较多报道其对植物有抑制病菌、促进生长作用[14-16]；还能产生絮凝剂，用于处理酿酒废水处理，具有高效净水的功能[17-18]。沙沙等研究表明，暹罗芽孢杆菌具有产纤维素酶功能，酶活力可达到0.168 6 U·g-1[19]。在本研究中接种发酵组发酵过程暹罗芽孢杆菌均为优势种群，比自然发酵组总含量提高了10倍。关于本研究获得的暹罗芽孢杆菌的功能及成为优势种群的机制，有待于进一步研究。

本研究结果表明，随着发酵时间的增加，笋壳中添加乳酸菌发酵的物料中的总氮、有机碳化合物(COD)显著高于自然发酵组，可培养芽孢杆菌数量也显著高于自然发酵；而且，接种发酵组不同发酵阶段的物料中的优势芽孢杆菌种群均为暹罗芽孢杆菌。