样本预处理方式对罗氏沼虾碳和氮稳定同位素比值检测的影响

李 月 刘 晃 谢正丽

(中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海 200092)

近些年，测定生物组织中自然产生的稳定同位素成为了生态学研究的重要工具，涉及的稳定同位素有碳稳定同位素、氮稳定同位素等[1]。其中碳稳定同位素比值(δ13C)常被用作确定食物网中消费者的食物来源，而氮稳定同位素比值(δ15N)则被用作确定食物网的结构和营养级[2]。

通过检测水产品中的δ13C、δ15N，可为水产品的生长性能[3]、摄食食性[4-6]、产地溯源[7-9]等研究提供数据参考。罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)俗称大头虾，是一种大型淡水虾,因其高蛋白、低脂肪、富含人体必需的矿质元素和不饱和脂肪酸特点而深受国民喜爱，在我国的养殖产量已连续多年居世界第一[10]。准确检测罗氏沼虾的δ13C、δ15N，有利于开展罗氏沼虾的食性、溯源等相关研究。由于稳定同位素比值检测的样本微量要求，新鲜采集的罗氏沼虾不能立即选取肌肉组织进行检测，有时需要冷藏、冷冻甚至短暂的常温整虾保存，直到有条件才进行制样分析。而目前有关水产品δ13C、δ15N检测的样本预处理方式尚无统一标准，各研究者采用的预处理方式差异较大，不同预处理方式对水产品碳、氮稳定同位素比值造成的影响可能不同[11-14]。

冷冻保存对样本稳定同位素比值的影响说法不一。有研究表明，冷冻保存对δ13C、δ15N没有影响[11，15-17]，因为冷冻保存不涉及引入传统化学法保存中的福尔马林、甲醇等有机试剂[12，18-19]；也有研究发现冷冻保存对δ13C、δ15N有影响，甚至有些是明显的影响[13，20-21]。此外，冷冻保存不适合野外采样，大多水产品野外采样受环境条件所限，在短时间之内较难实现快速冷冻保存，通常只能暂时常温或冷藏保存样本。水产品稳定同位素检测的取样方式有肌肉取样、整体取样，目前已有水母[21]、浮游动物、糠虾[20]、文蛤[19]等进行整体取样的报道，也有头足类[21]、鳕鱼[14]、虹鳟[19]等进行肌肉取样的报道。整体取样操作方便快捷，而肌肉取样能消除肠道等其他生物物质对样本的影响[22-23]，但肌肉取样过程中可能使样本受到外界环境污染，影响稳定同位素比值检测。目前，对于整体取样和肌肉取样的样本是否存在差异的研究甚少[24]。

因此，本研究探讨了3种保存温度(常温23℃/15 d、冷藏2℃/90 d、冷冻-18℃/360 d)、2种取样方式(虾仁取样、整虾取样)对罗氏沼虾稳定同位素比值检测的影响，讨论不同预处理方式所引起的罗氏沼虾δ13C、δ15N、C/N差异，以期为水产品碳和氮稳定同位素检测的样本预处理方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

第一批活体沼虾(单只约15 g，个头大小基本一致)于2018年5月购自上海市虹口区曲阳菜市场，数量50只，用于不同保存温度试验。第二批活体沼虾(单只约15 g，个头大小基本一致)于2019年8月购自上海市虹口区曲阳菜市场，数量100只，用于不同取样方式试验。

δ13C的国际稳定同位素比值参考标准物质为Ⅴ-PDB，δ15N的参考标准物质为AIR(空气)，此外，标准品选用德国IVA公司的尿素(δ13C = -41.30‰，δ15N = -0.32‰)，用于样本稳定同位素比值的校正分析。

1.2 仪器与设备

Delta V Advantage稳定同位素质谱仪，美国ThermoFisher公司；BPG-9920AG鼓风干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司；Classic DI超纯水仪，英国ELGA公司；XS分析天平，美国METTLER TOLEDO公司；KG33NV冰箱，德国SIEMENS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样本前处理方法 第一批沼虾购买后于10 min内进行初步处理。随机选取单只沼虾，去除虾壳后用超纯水洗涤取虾肌肉(虾仁)组织，每个样本放置于干净的玻璃培养皿中，用一次性塑封袋密封，避免受到外界环境污染。样本分为4组，第1组作为对照组，取虾仁样本直接干燥后检测δ13C、δ15N、C/N。第2组取15只虾仁样本在23℃±1℃(室温)条件下保存15 d。第3组取16只虾仁样本在2℃±1℃(冷藏)冰箱冷藏层保存90 d。第4组取12只虾仁样本在-18℃±1℃(冷冻)冰箱冷冻层保存360 d。

第二批沼虾购买后于10 min内进行初步处理。随机选取单只沼虾，一部分去除虾壳后用超纯水洗涤取虾仁组织；一部分取整虾，样本放置于干净的玻璃培养皿中，用一次性塑封袋密封，避免受到外界环境污染。2种取样方式的样本保存温度与第一批相同，保存时间为15 d。

取样间隔周期：保存15 d以内的样本取样间隔周期为1 d，保存90 d以内的样本取样间隔周期为5 d，保存360 d以内的样本取样间隔周期为30 d。(注：随机选取2019年冷冻9 d时的整虾样本10只，检测得到样本间的δ15N标准偏差为0.08，δ13C标准偏差为0.10,C/N标准偏差为0.03，3个参数的标准偏差在可允许的仪器误差范围之内，说明随机选取单只沼虾作为独立样本具有可行性，单个样本之间的差异可以忽略，样本数据的显著差异主要由不同预处理方式引起。)

1.3.2 δ13C值和δ15N值检测 选取沼虾肌肉组织进行δ13C、δ15N和碳氮元素的质量百分含量检测[13，25-26]。将冷藏和冷冻保存的样本从冰箱取出后放至室温，然后放入60℃烘箱中干燥至恒重；将常温保存的样本直接放入60℃烘箱中干燥。使用干净的玻璃研钵将干燥后的虾肉样本研磨成粉末状。称取0.2 mg虾肉样本放置锡杯中压扁。通过元素分析仪(Flash 2000系列)与Delta V Advantage稳定同位素质谱仪进行碳和氮稳定同位素比值检测，稳定同位素仪器多次运行得到的δ13C和δ15N的分析精度均<0.1‰。为确保结果的准确性和重复性，每个样本进行3次重复检测，每检测11个样本后，分别穿插标准品检测。δ13C、δ15N、C/N和3个参数的偏移量分别按下式计算：

δ13C=1 000×(Rm13-Rr13)/ Rr13

(1)

δ15N=1 000×(Rm15-Rr15)/ Rr15

(2)

C/N=m(C)/m(N)

(3)

ΔX =X(处理组)-X(对照组)

(4)

式(1)、式(2)中，δ13C和δ15N为实际样本与参考标准样本同位素比值的千分差，Rm13为实际样本的13C同位素比值，Rr13为参考标准样本的13C同位素比值；Rm15为实际样本的15N同位素比值，Rr15为参照标准品的15N同位素比值。式(3)中，m(C)为碳元素的质量百分含量，m(N)为氮元素的质量百分含量。式(4)中，Δ为偏移量，X为δ13C或δ15N或C/N。

1.4 数据统计分析

使用方差分析统计不同保存温度条件下，样本与对照组之间的δ13C、δ15N、C/N差异，显著性水平P设置为0.05。使用配对的t检验评估虾仁取样和整虾取样的偏移量是否显著，显著性水平P设置为0.01。所有统计分析均使用SPSS 16.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同保存温度对样本碳和氮稳定同位素比值的影响

在室温条件下保存，第1天沼虾有轻微异味产生，较粘稠，体表颜色由自然、透明而变深；第2天虾肉局部腐烂，有较强的氨气等异味；第3天肉质发黄，异味感强烈；第15天时，样本袋中虾仁样本消失，袋内出现寄生虫等生物。δ15N与对照组相比均显著增加，第1～第15 天偏移量为1.31‰～13.16‰，偏移量平均值为6.02‰(表1)，其增幅和增速明显高于冷藏、冷冻保存的δ15N(图1)。而δ13C增幅相比δ15N明显放缓(图2)，第3～第6天、第8天、第12～第15天的 δ13C 与对照组相比差异显著，偏移量为 0.19‰～0.56‰，偏移量平均值为0.33‰(表1)。C/N随着保存时间的延长呈持续增加的趋势(图3)，第2～第15天的C/N偏移量为0.19～0.70，偏移量平均值为0.38(表1)。

在冷藏条件下保存，第1～第11天虾肉呈半透明，有光泽，弹性尚好。此后肉质发黄，有较重的氨味，第15天时虾肉局部发生腐烂，肉质发红变黄。δ15N在第1～第35天接近于对照值，其变化幅度低于常温、冷冻保存的δ15N(图1)。第30～第55天、第65～第90天，δ15N显著增加，偏移量为0.31‰～3.16‰，偏移量平均值为1.07‰(表1)。δ13C 在第5～第90天内发生明显偏移，偏移幅度与常温保存条件下的δ13C接近(图2)，第5～第55天、第65天、第90天的偏移量为-0.35‰～0.70‰，偏移量平均值为0.25‰(表1)。C/N 与对照组相比降低(图3)，第5～第30天、第65～第90天的偏移量为-0.55～-0.06，偏移量平均值为-0.24(表1)，变化趋势与常温的C/N相反。

在冷冻条件下保存，第30～第365天内解冻后的虾体半透明、有光泽，弹性尚好，无异味产生。δ15N在第60～第240天明显降低，偏移量为-1.40‰～-0.31‰，偏移量平均值为-0.79‰，变化趋势与常温、冷藏保存的δ15N相反，而在第270～第360天δ15N增加，偏移量为1.04‰～1.39‰，偏移量平均值为1.15‰(表1)。δ13C在第90 ～第240天小幅度增加，偏移量为0.07‰～-0.41‰，偏移量平均值为0.22‰，而在第270～第360天增加明显，远高于常温和冷藏保存条件的δ13C(图2)，偏移量为 2.34‰～2.84‰，偏移量平均值为2.57‰(表1)。C/N整体降低明显(图3)，第90～第180天，第240～第360天，偏移量为-1.34～-0.67， 偏移量平均值为-1.14(表1)。可见，在第180 ～第240天，冷冻条件下的δ15N、δ13C、C/N各参数值均有发生转折变化。

图1 3种保存温度对罗氏沼虾δ15N的影响Fig.1 Effect of three preservation temperature on δ15N values of Macrobrachium rosenbergii

图2 3种保存温度对罗氏沼虾δ13C的影响Fig.2 Effect of three preservation temperature on δ13C values of Macrobrachium rosenbergii

图3 3种保存温度对罗氏沼虾C/N的影响Fig.3 Effect of three preservation temperature on C/N values of Macrobrachium rosenbergii

表1 3种保存温度样本δ13C、δ15N、C/N与对照组的差异Table 1 Differences of δ13C、δ15N、C/N between three preservation temperatures treated samples and control sample

2.2 不同取样方式对样本碳和氮稳定同位素比值的影响

虾仁取样和整虾取样对样本δ15N、δ13C影响明显，影响的方向(增加或减少)与保存温度条件有关。2种取样方式在常温保存下δ15N、δ13C、C/N的偏移方向一致：δ15N偏移均增加(图4-A)、δ13C偏移均减少(图5-A)、C/N偏移均增加(图6-A)；而2种取样方式在冷藏、冷冻保存下δ15N、δ13C、C/N的偏移有增加也有减少(图4～图6)。

2种取样方式在冷冻和常温保存下的δ15N偏移方向整体相反。在冷冻保存第2～第13天，整虾取样的△δ15N 整体明显高于虾仁取样的△δ15N(表2)，整虾取样的△δ15N为-1.00‰～1.99‰，虾仁取样的△δ15N为 -2.44‰～0.83‰(图4-C)。而在常温保存第3～第15天，整虾取样的δ15N偏移量显著低于虾仁取样的δ15N偏移量(表2)，整虾取样的△δ15N为 0.30‰～ 5.70‰，虾仁取样的△δ15N为-0.71‰～7.84‰(图4-A)。

整虾取样在冷冻保存下的δ13C偏移量整体显著高于虾仁取样的δ13C偏移量(表2)，在冷冻保存第2～第13天，整虾取样的△δ13C为-0.57‰～0.40‰，虾仁取样的△δ13C为-1.19‰～0.65‰(图5-C)。整虾取样在常温保存下的C/N偏移量也整体显著高于虾仁取样的C/N偏移量(图6-A)，在常温保存第1～第15天，整虾取样的△C/N为0.17～1.53，虾仁取样的△C/N为0.16～0.89(图6-A)。2种取样方式在冷藏、冷冻保存下的C/N 偏移量大多无显著差异(表2)。

综上可知，由于罗氏沼虾含水量多、蛋白质含量较高[25-26]，3种保存温度条件均容易引起样本碳和氮稳定同位素比值的显著变化，2种取样方式下样本δ13C、δ15N的偏移量也有显著差异，增加或减少还与保存温度条件有关，影响了样本检测数据的真实性。在常温保存第1～第15天内样本同位素比值整体明显增加，δ15N变化尤为显著，其偏移量远高于冷藏90 d、冷冻保存360 d的δ15N偏移量；冷藏保存第5～第90天样本δ15N整体增加，δ13C变化明显，C/N整体明显减少；冷冻保存罗氏沼虾不宜超过60 d，在第60～第360天样本的δ13N、δ15N、C/N均整体发生变化，在第240～第360天变化尤为显著。

3 讨论

在野外采集罗氏沼虾后不能及时进行新鲜样本的稳定同位素比值检测时，常会将样本进行保存预处理。目前有关样本保存温度、样本取样方式预处理对δ13C、

表2 3种保存温度下2种取样方式的△δ15N、△δ13C、△C/N T检验分析结果差异Table 2 Results between the two sampling treated samples (△δ15N、△δ13C、△C/N) at three preservation temperatures of t-test

注：A:常温保存； B:冷藏保存； C:冷冻保存。下同。Note: A: Room temperature preservation. B: Refrigerated preservation. C: Frozen preservation. The same as following.图4 2种取样方式与对照组罗氏沼虾δ15N偏差的变化Fig.4 Changes in δ15N values of Macrobrachium rosenbergii under the two different sampling treatments relative to the control samples

图5 两种取样方式与对照组罗氏沼虾δ13C偏差的变化Fig.5 Changes in δ13C values of Macrobrachium rosenbergii under the two different sampling treatments relative to the control samples

图6 两种取样方式与对照组罗氏沼虾C/N偏差的变化Fig.6 Changes in C/N values of Macrobrachium rosenbergii under the two different sampling treatments relative to the control samples

δ15N影响的说法不一，不同预处理方式下的样本检测结果准确度无法保障。因此，本研究选取3种保存温度(常温23℃/15 d、冷藏2℃/90 d、冷冻-18℃/360 d)、2种取样方式(虾仁取样、整虾取样)，以新鲜沼虾样本作为对照组，研究不同保存温度和取样方式对罗氏沼虾δ13C、δ15N、C/N的影响。结果表明，3种保存温度、2种取样方式对罗氏沼虾碳和氮稳定同位素比值具有明显影响，这与Syvaranta等[13]、Wolf 等[20]、Fleming等[21]的研究结果相似。

本试验中，常温保存样本的δ15N、C/N在第1天显著增加(表1)，结合其外部形态变化，原因是细菌分解引起样本氮元素质量和较轻的氮同位素减少。常温保存条件接近虾体附带的嗜冷菌的最适温度[27]，加之虾肉水分和蛋白质含量高(水分含量77%～78%，粗蛋白含量17%～20%)[27-28]，虾肉在常温条件下极易被附带的细菌分解。李燕等[29]发现罗氏沼虾于10℃条件保存时，第2天细菌达到3.3×107CFU·g-1(平均需氧平板计数)，超过可接受的107CFU·g-1极限值。Shamshad等[30]测定墨吉对虾在0～35℃条件保存24 h后，平均需氧平板计数由5.0×105CFU·g-1增至6.4×109CFU·g-1。细菌在繁殖过程中产生各种酶类和毒性物质，这些物质促使虾肉组织分解代谢为较简单的氨、胺类等挥发性含氮物质[31]。随着保存时间延长，含氮化合物等挥发性成分不断形成并挥发损失，当氮元素的损失量高于碳元素的损失量时，C/N明显升高。此外，由于微生物在分解过程中的运动同位素效应和同位素分馏作用[32]，在常温下保存，沼虾肌肉δ15N随时间延长而显著增加。

冷藏保存显著影响罗氏沼虾的δ13C、δ15N。样本冷藏保存第11天时肉质开始腐烂，δ13C从第5天起发生显著变化，δ15N从第40天时显著增加(表1)。随着冷藏保存时间的延长，沼虾肌肉组织也会逐渐被微生物分解，从而导致δ13C、δ15N持续增加，有研究表明在5℃条件冷藏保存15 d内，从虾的提取物中发现了三甲胺/氨气等可挥发氮物质[33]，冷藏条件下C/N降低，说明碳元素的损失量大于氮元素的损失量。样本在不同温度下的优势菌种不同，可能是常温和冷藏保存条件下 δ13C、δ15N的变化时段不同的原因。

冷冻保存在60 d内对罗氏沼虾的δ13C、δ15N无显著影响，长时间冷冻保存变化明显。冷冻常被作为一种理想的样本保存方式，普遍认为其不影响样本稳定同位素比值[11，15,17]，更有研究报道冷冻条件下的有效保存时间可达24个月之久[34]。虽然本试验在冷冻保存360 d内虾体解冻后的外观良好，然而冷冻60 d后沼虾δ13C、δ15N、C/N均发生明显变化(图1～图3)，这与一些研究报道冷冻显著影响浮游动物的δ15N[21]、文蛤的δ13C、δ15N[13]、糠虾的δ13C、δ15N[20]的结果相似，如δ13C文蛤在-20℃冷冻保存7 d后δ13C和δ15N与新鲜样本组相比变化显著[18]；糠虾在-10℃冷冻保存7 d后δ13C、δ15N与对照组相比变化显著，δ13C差异为0.76‰±0.41‰,δ15N差异为0.37‰±0.16‰[20]；水母在-20℃冷冻保存6个月后δ13C差异为2‰[21]。

冷冻保存后的样本δ13C、δ15N和C/N显著降低，可能是由样本在解冻过程中，冰晶形态分布发生改变，肌肉组织细胞破裂使细胞液流出，并发生脂肪氧化和蛋白质氧化变性共同导致[35-37]。Salonen等[35]研究发现牡蛎在冷冻保存期间碳元素质量显著减少，Feuchtmayr等[36]对比正常冷冻样本 (-20℃) 与液氮冲击冷冻样本对浮游动物δ13C和δ15N的影响，发现δ13C、δ15N减少与细胞物质的浸出有关。Dannheim等[24]推测海底大型底栖动物样本在整体冷冻保存后发生细胞机械破坏溶解，导致样本碳氮损失。

本试验中的2种取样方式显著影响样本δ13C、δ15N。不同形态的样本在不同温度条件下受到机械破坏的程度不同。在冷冻条件下，与虾仁样本相比，整虾样本的体积和质量更大，需要更长的平衡时间。较慢的冷冻会在样本组织内形成较多的冰晶，而冰晶会机械破坏样本组织细胞，最终导致细胞液泄漏发生物质损失[35-36]。在冻结过程中，液体体积膨胀与样本质量的拮抗力引起的机械应力可能也会进一步损伤组织细胞。在冷冻和解冻的过程中，组织细胞受到破坏，细胞物质流出和脂肪酸、蛋白质氧化等因素综合引起了整虾和虾仁取样后样本δ15N、δ13C的不同。在常温条件下，虾仁取样的δ15N整体显著高于整虾取样，可能是由于虾仁相比整虾没有虾壳保护、完全暴露于空气中，常温下与微生物接触发生分解的速度更快，而微生物等生命体在合成脂肪的过程中，会发生明显的碳歧视效应，即趋向于利用较轻的12C合成脂肪[38-40]，导致2种取样方式的δ13C偏移量不同。今后研究需要进一步结合样本组织细胞物质流出、微观结构观察，以筛选更加可靠的碳和氮稳定同位素检测的样本保存及取样方式预处理方法。

4 结论

本研究结果表明，常温(23℃)和冷藏(2℃)保存不适合罗氏沼虾稳定同位素比值检测、冷冻(-18℃)保存罗氏沼虾不宜超过60 d；整虾取样和虾仁取样对样本δ15N、δ13C也有显著影响，偏移量的增加或减少与保存温度有关。因此，在检测水产品碳、氮稳定同位素比值时，需慎重考虑不同保存温度和取样方式对检测结果的影响。建议新鲜沼虾采集后立即干燥并开展碳和氮稳定同位素比值检测。