三叶青突变体的理化成分评价与分子鉴定

董云哲 金泽兰 林宏峻 沈晓霞 高志伟 周志丹 王忠华,*

(1 浙江万里学院生物技术研究所，浙江 宁波 315100；2 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402；3 杭州中泽生物科技有限公司，浙江 杭州 310023)

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，又名蛇附子、金线吊葫芦、石老鼠等，为葡萄科崖爬藤属多年生常绿草质蔓生藤本植物，广泛分布于我国中部、东部、南部诸省[1-3]。三叶青自明代《本草纲目》首次记载[4]以来，被广泛用于清热、解毒、消炎、止痛、惊厥、肺炎、肝炎、脑膜炎、蛇虫叮咬[5]等病症；近年来，其在抗炎[6]、抗氧化[7]、抗癌[7-11]等方面的作用被不断验证；三叶青中多糖[8,12]、黄酮[13]、酚酸[4]、矿物质、氨基酸等药理成分对细胞[8,10]、机体[14-15]的作用机制已被逐步阐明，尤其为癌症治疗提供了新的视野与研究方向[16-17]。然而，目前三叶青的种质资源大部分来自野生或地方种，种质资源匮乏问题已成为三叶青产业发展的瓶颈之一。因此，近年来杂交、快繁、突变、转录代谢等多种种质研究技术被不断应用到三叶青优良种质培育的研究中，且取得了一定进展[18]。同时，杭州中泽生物科技有限公司、浙江大学等单位使用60Co-γ辐射育种技术，以新选育的三叶青新品种泽青1号为亲本进行诱变育种，获得了一批突变体，为三叶青新品种选育提供了资源条件。

目前，前人关于三叶青分子鉴定或亲缘遗传的研究以不同品种三叶青居多[19-25]，在品种选育、遗传、进化的研究上具有一定限制性，使其研究范围只能局限在生物分类学的种及以上层级中，对种内优良品种的选育贡献度有限，对种内品种选育、进化分析参考价值同样具有局限性。因此本试验所用的三叶青突变体为60Co-γ射线处理泽青1号得到，弥补了上述前人所选材料的不足，使得本研究兼具科研和商业价值。此外，多数前人研究中仅以总酮含量为不同品种三叶青的差异指标，缺乏其他指标的对比，其试验结果说服力有限。鉴于此，本试验以泽青1号突变体为研究对象，采用现代分析技术进行多糖、总酮、矿物质、氨基酸等多种药效成分的检测，以期明确这些突变体的育种利用价值，综合筛选适宜商业种植的品系，为三叶青的多元化定向化育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

材料为三叶青泽青1号及其突变体101、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、120、123、124、125、126、127、130、131、132的叶片与成熟块根，以及中泽、广西、ZD-2的叶片与成熟块根。叶片采集日期为2021年4月15日。其中突变体采用200 Gy的60Co-γ射线处理三年生的泽青1号种子培育而成，三叶青块根在40℃下干燥后磨粉，过100目筛备用，叶片置于-80℃超低温冰箱中备用。

ICAP6300电感耦合等离子体发射光谱仪，美国Thermo；L8900全自动氨基酸分析仪，日本HITACH；Acquity/NamoUPLC/Synapt G2 MS/LC-MS液相色谱质谱联用仪，美国Waters；Barnstead LabTower EDI 超纯水仪，美国Thermo；ETHOS 1微波消解仪，意大利Milestone；SQP电子分析天平，型号BSA124 S，德国Sartorius。

试剂为：牛血清蛋白标准品、考马斯亮蓝G250、无水乙醇(分析纯)、葡萄糖标准品、硫酸(分析纯)、矿物质元素混标溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)、硝酸(优级纯)、甲醇(色谱纯)、氨水(色谱纯)、乙腈(色谱纯)。

1.2 试验方法

1.2.1 总物质含量测定 建立总糖(可溶多糖)、总酮、总皂苷、总蛋白(可溶蛋白质)、总酚的五因素(溶剂浓度、料液比、超声功率、温度、时间)五水平正交体系共25组，以泽青1号干粉为材料筛选最优试验方案：称取1.0 g泽青1号干燥粉末，按照正交表试验组依次控制条件进行。超声结束，冷却至室温，用该试验组浓度乙醇溶剂补足失重，4℃静置过夜，3次重复。

1.2.2 矿物质含量测定 混标溶液Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn，5%硝酸(优级纯)梯度稀释，以标准品质量浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，建立线性回归方程。精密称取0.300 0 g药材粉末于聚四氟乙烯消解罐中，加入优级纯浓硝酸5 mL、双氧水3 mL，装入微波消解仪中进行消解，10 min升温至180℃，全程40 min，冷却至室温后取出，5%硝酸定容至10 mL，4℃保存，3次重复。样本定容液置于电感耦合等离子体发射光谱仪上机测定，具体步骤参考仪器说明书。

1.2.3 游离氨基酸含量测定 选定泽青1号、101、103、107、109、112、113、114、126、中泽、广西共11个株系突变体，3次重复。称取1 g样品，用50 mL 0.04 mol·L-1盐酸(优级纯)浸提30 min；摇匀后过滤，吸取滤清液2 mL于离心试管中，加入8%磺基水杨酸2 mL，混匀，静置15 min；10 000 r·min-1离心10 min；取上清液，过0.22 μm膜后全自动氨基酸分析仪上机，输出图谱换算单位含量分析，具体步骤参考仪器说明书。

1.2.4 DNA条形码分析 使用DP360多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取突变体叶片DNA，使用E035 2×Fast Pfu Master Mix(上海近岸蛋白质科技有限公司)按说明书添加DNA与引物ITS4(5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′)反应体系(50 μL)进行PCR扩增；对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：135V/135 mA/35 min)，分离特异性条带并割胶回收送至杭州擎科生物公司测序；通过Sequencing Analysis 5.2分析峰图数据，并使用DNAMAN、MEGA-X MEGA7.0等进行多序列比对、突变位点筛选、同源性分析、BLAST比对、特异引物与探针设计等操作。

2 结果与分析

2.1 正交体系分析

三叶青超声提取正交体系中25组方案各组总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚的单位含量分布(图1)和浓度分布(图2)显示，第1、第8、第15、第17及第24组提取效果较好，最优提取方案为：取1.0 g样品粉末置于50 mL离心管，向离心管中加入25 ml 50%乙醇，将离心管置于超声设备中；超声设备控温60℃，以功率400 W对样品溶液持续超声处理25 min。正交体系中25组方案的总物质单位含量(图1)显示，25组含量折线之间纵向增幅不同、不相交且整体趋势相同，表明总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚五类总物质间具有一定相关性。

2.2 总物质相关性分析

以正交体系所得最优提取方案提取26份三叶青样本的总物质，以泽青1号的总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚的单位含量为对照，计算各突变体总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚的含量，通过含量差异以Kendalls、Pearson、Spearman函数计算总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚之间的相关系数(图3)，结果表明，在26份样本中，总糖、总酮、总皂苷三者之间具有极显著相关性，总糖、总酮、总皂苷三者与总酚之间具有显著相关性，总蛋白与其他总物质相关性普遍较低。

2.3 总物质含量差异

以泽青1号的总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚单位含量百分制差异(表1)为对照，辅以傅里叶红外变换光谱(图4)初步筛选出125、126、127、130、131、132共6个具有含量优势、潜在定向育种价值的突变体。

注：G1：总糖；G2：总酮；G3：总皂苷；G4：总蛋白；G5：总酚。下同。Note：G1: Total polysaccharides. G2: Total ketones. G3: Total saponins. G4: Total protein. G5: Total phenols. The same as following.图1 三叶青超声提取正交体系25组方案各组总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚的单位含量分布Fig.1 Unit content distribution of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins,and total phenols in 25 groups of orthogonal ultrasound extraction system of T.hemsleyanum

图2 三叶青超声提取正交体系中总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚的浓度岭图分布Fig.2 Concentration ridge map distribution of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins,and total phenols in orthogonal ultrasound extraction system of T.hemsleyanum

图3 三叶青中总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚之间的Kendalls、Pearson、Spearman相关系数Fig.3 Kendalls,Pearson and Spearman correlation coefficients of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins and total phenols in T.hemsleyanum

2.4 矿物质含量分析

2.4.1 矿物质标准限量分析 26份三叶青样本矿物质元素单位含量(图5)显示，在突变体113、123、124和131中未检出As元素，其他元素在26份样本中均有检出，且含量不同。

急性阑尾炎是一种常见的外科疾病。该疾病的特征是转移性右下象限疼痛。这种疾病在年轻人中很常见[1-3]。前一天,临床上急性阑尾炎主要是手术切除[4],如果延误诊断和治疗,可能会引起严重并发症。早期症状高热,呕吐等症状严重者将导致穿孔,使患者的健康受到严重影响[5]。因此,在诊所采取合理有效的治疗和护理干预是非常重要的。本研究的目的是调查中医和西医护理干预对急性阑尾炎的临床疗效及其对急性阑尾炎患者生活质量的影响,为临床治疗提供指导。

矿物质单位含量基础指标显示，最大单位含量Al(1 285.689 mg·kg-1)、Fe(323.711 mg·kg-1)、Mg(2 297.569 mg·kg-1)、Zn(156.906 mg·kg-1)均在100.000 mg·kg-1以上；最大单位含量As(1.861 mg·kg-1)、 Ba(81.070 mg·kg-1)、Cr(7.201 mg·kg-1)、 Cu(12.451 mg·kg-1)、Mn(97.527 mg·kg-1)、 Pb(1.967 mg·kg-1)均在100.000 mg·kg-1以下。参照《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[26]，重金属及有害元素Cu、As和Pb在标准限量范围内(Cu≤20.0 mg·kg-1、 As≤2.0 mg·kg-1、Pb≤5.0 mg·kg-1)，均符合要求。

2.4.2 矿物质含量差异 各突变体目标元素含量差异(图5、6)表明，泽青1号对目标元素的贮存能力普遍高于大部分突变体，但部分突变体中As、Ba、Cu、Mg、Mn、Pb、Zn等元素的含量高于泽青1号，而在Cr、Fe、Al的指标中以泽青1号最高。以上述指标筛选出103、107、112、113等4个部分元素含量高于泽青1号的突变体(图9)。

突变体103、107中As含量高于泽青1号(1.501 5 mg·kg-1>1.115 7 mg·kg-1、 1.860 5>1.115 7 mg·kg-1)，107中Cu含量亦高于泽青1号(12.451 2 mg·kg-1> 7.703 7 mg·kg-1)，但均未超出限量；107、112中Mg含量高于泽青1号(2 242.025 4 mg·kg-1>2 125.264 5 mg·kg-1、 2 297.569 2 mg·kg-1>2 125.264 5 mg·kg-1)，112、113中Mn含量高于泽青1号(227.630 8 mg·kg-1>217.765 8 mg·kg-1、253.747 7 mg·kg-1>217.765 8 mg·kg-1)；此外，Cr、Fe、Al含量则均以泽青1号为最高(7.201 0、323.711 3、1 285.689 1 mg·kg-1)。

表1 26个三叶青样本总糖、总酮、总皂苷、总蛋白、总酚的单位含量百分制差异Table 1 The percentage difference of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins and total phenols in 26 samples of T.hemsleyanum /%

图4 泽青1号及其突变体的傅里叶红外变换光谱图Fig.4 Fourier transform spectra of 11 samples from Zeqing 1 and its mutants

注：编号100为泽青1号。Note：Number 100 indicate Zeqing 1.图5 26个三叶青样本的矿物质元素单位含量分布Fig.5 Mineral element unit content distribution of 26 samples from T.hemsleyanum

2.4.3 矿物质相关性分析 对Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn共10项指标进行相关性分析，结果表明(图8)，目标元素间具有普遍的显著相关性，集中在Al、Fe、Mg、Zn、Mn 5个元素中；Fe与Mn具有相近的分布特征，Al、Mg、Zn则分布特征相差较大，反映了突变对部分矿物质代谢通路影响的相似程度，与其正态分布基本符合(图9)。

图6 26份三叶青样本在各元素中的百分制权重Fig.6 The percentage proportion of 26 samples of T.hemsleyanum in each mineral element

2.4.4 矿物质主成分分析 载荷系数表明，所有研究项对应的共同度值均高于0.4，表明研究项和主成分之间有着较强的关联性，主成分可以有效地从Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn提取出信息。可知上述元素均具有良好的载荷性，可作为三叶青各突变体株系的特征性成分(图10)。

2.5 游离氨基酸含量分析

2.5.1 游离氨基酸含量差异 结果表明，Cys、Leu在11突变株系中均未检出；Asp、Thr、Glu、Gly、Ala、Val、Phe、Lys、His、Arg 10种游离氨基酸在11株系中均有检出；Ser只在101株系中检出；Met在101、114、126 3个株系中未检出，其他株系均有检出；Tyr只在109株系样品中检出，其他株系均未检出。107、109、112、113突变株系的特征性氨基酸和总氨基酸量均高于泽青1号(图11)。有研究表明，总氨基酸能明显降低肝脏丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性、肝脏指数和丙二醛含量，提高活菌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，对肝脏损伤具有良好的保护作用[27-28]；总氨基酸作用于肝癌细胞HepG2信号转导途径上具有良好效果[22]。因此筛选出107、109、112、113四个具有成分育种潜力的突变体。

2.5.2 游离氨基酸相关性 Asp、Thr、Glu、Gly、Ala、Val、Phe、Lys、His、Arg、Ser、Met、Ile、Tyr 14项相关性分析(图12)，结合各游离氨基酸的正态检验(表2)分布结果表明，各突变体中各元素间没有显著的相关性，但Asp、Glu、Val、Phe等少数几个元素在部分突变体中具有相似的含量分布特征，反映了突变对部分氨基酸代谢通路影响的相似程度。

图7 泽青1号及其突变体103、107、112、113的矿物质含量差异Fig.7 Differences of the mineral content of Zeqing 1 and its mutants 103,107,112,113

图8 三叶青矿物质间相关性分析Fig.8 Correlation analysis between the minerals in T. hemsleyanum

表2 泽青1号及其突变体的游离氨基酸正态性检验分析Table 2 Analysis of the normality test of free amino acids of Zeqing 1 and its mutants

图9 26份三叶青样本在10个特征元素中的正态分布Fig.9 The normal distribution of 26 samples of T.hemsleyanum in 10 characteristic mineral elements

图10 26份三叶青样本的矿物质二维、三维主成分分布Fig.10 The two-dimensional and three-dimensional distribution of principal component of mineral elements in 26 samples of T.hemsleyanum

2.6 DNA条形码分析

2.6.1 DNA提取和ITS引物扩增 扩增结果(图13)显示，突变体123未检出条带，其余突变体胶图中1 000、750、500 bp位点附近均产生清晰、明亮、特征性一致的条带分布；而后对突变体123共进行7次重复试验后均未检出条带。结果表明，泽青1号突变为123株系过程中与ITS引物结合位点处发生突变，导致引物无法结合而未扩增出条带，但其余株系未出现此类突变，可扩增出特征性一致的条带。

2.6.2 突变体与近缘崖爬藤属植物序列分析 使用 MEGA-X 对三叶青突变体ITS4引物扩增带进行序列比对，并与符渊淼[18]公布的三叶青近缘种属植物的ITS4扩增条带序列进行差异分析(图14)，结果显示，泽青1号突变类群与近缘种属序列间具有丰富的变异位点，且泽青1号突变类群间具有较高的同源性，泽青1号突变类群与其近缘种可直观地区分开。

使用MEGA7.0以Neighbor-Joining构建突变类群与近缘种属序列的起源进化树Original Tree(图15)与自举共识树(Bootstrap Consensus Tree)，进化树均显示可将近缘种属聚为一类与突变类群显著区分；DNAMAN所构建的Original Tree与MEGA7.0所构建的Original Tree(图15)结果相似，且显示泽青1号突变类群与其近缘种属序列组仅有49%的同源性，而突变体间同源性多近似为100%，均表明可以显著区分泽青1号突变类群与其近缘种。

总体结果表明，所选引物ITS4可以良好地区分泽青1号及其突变体与其部分近缘种属物种，初步认为ITS4具有作为泽青1号突变类群与近缘种属区分条形码的潜力。

图11 泽青1号及其突变体107、109、112、113的游离氨基酸含量差异Fig.11 Differences in free amino acid contents of Zeqing 1 and its mutants 107,109,112 and 113

2.6.3 突变体间序列分析 使用DNAMAN对多变体序列比对，从中提取一段包含丰富变异位点序列片段，该序列长度为160 bp[包含空位(gaps)]，该组片段多序列比对后显示：在提取序列一致性95.33%的基础上，以泽青1号为参照共产生244个突变位点，包括置换、缺失和插入3种突变类型，占总突变体提取序列的6.35%，可以对泽青1号单个突变体进行区分。在此基础上可以设计探针或特征引物，直接从PCR扩增条带泳图进行不同突变体的判断，这种方法可为后期突变株系的追踪和应用提供有效的帮助。此外，该段序列的同源性分析显示同源性在93%～99%之间，具有高度相似性。

图12 三叶青游离氨基酸间相关性分析Fig.12 Correlation analysis between the free amino acid in T.hemsleyanum

2.6.4 遗传距离分析 使用MEGAX进行遗传距离分析，泽青1号突变类群及其近缘种属的成对遗传距离(Pairwise Distance)结果显示，泽青1号突变类群各突变体间距离在0～0.167之间，近缘种属各突变体间距离在0.108～1.279之间，而泽青1号突变类群突变体与近缘种属突变体间距离则在0.474～1.587之间，表明泽青1号突变类群与近缘种属间具有明显差异，这种差异在DNA片段各处均有延伸，这种差异也是ITS4作为条形码的基础。

此外，MEGAX的遗传距离分析显示，泽青1号突变类群及其近缘种属的总平均遗传距离(Overall Mean Distance)为0.54；突变类群与近缘种属的种内平均遗传遗传距离(Within Mean Group Distance)分别为0.044、0.144，组间平均遗传距离(Between Group Mean Distance)为0.993，组间平均净遗传距离(Net Between Group Mean Distance)为0.899，这与Pairwise Distance所得结论相同。

使用MGEAX对参照DNAMAN多序列比对所获得的保守且变异位点特异、相对丰富的160 bp(部分突变体序列包含gaps)序列片段进行遗传距离分析，结果显示，泽青1号突变类群各突变体间距离Pairwise Distance在0.006 40～0.116 96之间，Overall Mean Distance为0.059 99，Within Mean Group Distance为0.060 70，说明泽青1号突变类群间在具有高度保守、高度同源性的前提下依旧可以产生相对丰富的变异位点，由ITS4所建立的条形码兼具种属鉴别和种间分子鉴定的功能。

2.6.5 突变类群的BLAST比对 以2.6.3提取的泽青1号160 bp序列进行BLAST比对(程序参数：discontiguous megablast)筛选出前100组来源石斛、拟南芥、棉花、莲藕、荔枝、马铃薯、可可豆、杜鹃等多种植物的相似序列，序列相似度最高为89.89%。

图13 三叶青样本的DNA引物扩增结果Fig.13 Results of DNA of primer amplificationof samples of T.hemsleyanum

图14 26份三叶青样本与近缘种的多序列比对Fig.14 Multiple sequence alignment of between 26 samples and its closely related species of T.hemsleyanum

图15 基于26份三叶青样本与23个近缘种的ITS序列构建同源树Fig.15 The Original Tree based on ITS sequences of 26 samples and its 23 closely related species of T.hemsleyanum

此外，通过DNAMAN对ITS4所扩增片段的测序结果进行多序列比对，将泽青1号的保守序列全部提取，得到一段517 bp突变丰富的片段并进行BLAST比对，筛选出前100组来源可可豆、甜瓜、罗汉果、番茄、野黄花、毛竹、茉莉花等多种植物、藻类的相似序列，序列相似度最高为74.48%；同时，对所提取的517 bp片段进行二次提取，分别得到500、400、300、200、100 bp片段，并进行BLAST比对，所得最高序列相似度依次为74.48%、74.48%、74.48%、73.27%、72.92%。结果表明，在避免目标序列长度过短和保证目标序列具有一定保守性的前提下，从三叶青中所提取的目标序列与BLAST检索序列的序列相似度稳定在70%～80%之间，说明在三叶青中仅需要一段具有一定保守性的小片段即可实现种属鉴别和种间分子鉴定；同时，提取序列的检索量与相似度和提取序列的长度与保守程度相关，提取序列长度与检索序列物种多样性一定程度上成反比，应尽可能包含高度保守和相对保守区，同时保证序列长度。

2.6.6 突变类群的DNA条形码构建 对泽青1号及其突变体序列进行DNAMAN多序列比对，结果显示突变位点较为平均地分布于各突变体中，同时发现几段极度保守、稳定的不连续片段，仅少数位点产生突变(图13)，以此获得一段拟DNA条形码的序列：5′-T G G G G A A A T G C T C A A A A A T A C C A T A T C C C C T A C C T C A A A C T C T A G G T C C C T A C G G G G A T T G C C C G A T T A A C T T T T G T G T C G G G C T T G G G A A A T T T T C G G A C T A T C C C T T A T A A C T T T G A T C T T A T C A C A A G G C A C T T G A A C A A T T T C C G G A C C T A C T A A T T T C C T T T C C C C T A C C T C G C C C C A A C A G A C T G A A G T T C A A C A T T T C C G T C C A T A A A G A G C C T C A T A A G G G G C C A T A C C A A T A C T G G T C T G A T A A C T G T T A T T G T A T G C A A A C T C C A T C A G G G A T A G A T G G G C G T C C C A G C T C C C T C T A A A C T C C A T A A C A C A T G C C CT-3′使用该序列进行BLAST比对，结果与2.6.5的比对结果相似，序列相似度均在80%以下，最终认为该段序列可以作为三叶青泽青1号及其突变体类群的DNA条形码序列。

3 讨论

60Co辐射诱变技术是当前植物种质资源开发的重要手段，如目前已对朝天椒[29]、小麦[30]、水稻[31]等多种作物进行了相关研究。本试验所用的三叶青突变体是采用200 Gy60Co-γ射线处理三叶青高产优质新品种泽青1号所得。因此在材料选择上具有科研和商业双向价值，一方面筛选出的优良突变体可直接应用于商业种植，另一方面泽青1号及其突变体是研究种质进化与分子标记技术的适宜样本，是进行分子改良的基础材料。前人关于三叶青理化性质的研究多仅以总黄酮含量为不同品种三叶青的差异指标[32-34]，缺乏其他总物质含量的对比。本试验使用中高浓度的有机乙醇溶剂进行五类不同极性的组分提取，构建五因素五水平正交试验验证该方法实用性，筛选优化体系；此外，本研究创新性地使用50%乙醇溶剂超声一体化提取总糖、总酮、总皂苷、总蛋白质、总酚五类不同极性的物质，完成多类物质总含量测定与相关性分析，能够在极大程度上节省人力物力，缩短操作流程，提高原材料利用率，为植物组分提取类研究提供有效的参考基础。

图16 26份三叶青样本中一段ITS序列保守序列的位点突变结果Fig.16 Results of site mutation in a ITS sequence conserved in 26 samples of Tetrastigma hemsleyanum

尹明华等[19]利用简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)荧光标记分析了64个三叶青种质样本的遗传多样性和亲缘关系，结果表明，遗传相似系数变化范围为0.115 4～0.954 5、遗传距离变化范围为 0.000 0～3.218 1,远高于本研究中突变体类群遗传距离(Pairwise Distance在0.006 40～0.116 96之间，Overall Mean Distance为0.059 99，Within Mean Group Distance为0.060 70)，但与突变类群突变体与近缘种属突变体间距离(0.474～1.587)存在交集，说明尹明华等[19]所用64个种质样本间的亲缘关系、种间距离差异较大，所有样本处于种间水平，且部分样本可能处于属间水平；而突变体类群间分析种内水平研究。根据以上研究推测，三叶青所在的崖爬藤属植物的种间界限遗传距离在0.116 96～0.474 00以上、3.218 10以下范围内。此外尹明华等[20-22]又分别使用随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、微卫星分子标记(inter-simple sequence repeat，ISSR)、相关序列扩增多态性分子标记(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)对上述64个三叶青种质样本的遗传多样性和亲缘关系进行分析，所得结论与上述研究结果相符，表明SSR、RAPD、ISSR、SRAP四种分子标记方式适用于种属水平的分子鉴定，不适用于种内水平。

DNAMAN多序列比对结果发现，本研究的突变位点分布并不均匀。结果显示TTT、AAA小片段序列极度保守，基本不发生突变，同时CCCC、GGGG小片段序列同样非常保守，不易突变。推测是由于相同碱基之间由于键能、键角等物理性质极为接近或相同，因此更易形成相对稳固的化学键，对外界诱导突变的抗性增加[35-36]。

由于本研究的对比序列较短，导致无法使用MEGA-X构建N-J(K-2)同源树，因此在后续研究中有必要提取分子量较大的序列进行分析，以放大同源性差异方便比对。本研究还发现，DNAMAN所得Bootstrap Consensus Tree结果受程序模式、序列长短和运算次数的影响，导致有时Bootstrap Consensus Tree运算没有正向的参考价值。

4 结论

本研究以正交方法构建并优化了三叶青总糖、总酮、总皂苷、总酚、总蛋白5种总物质一体化提取测定的有机溶剂超声提取体系，并结合矿物质、游离氨基酸两指标筛选出103、107、109、112、113、125、126、127、130、131、132具有潜在定向育种价值的突变体；另外研究表明三叶青突变体中的总糖、总酮、总皂苷三者单位含量与总酚之间呈显著相关，Al、Fe、Mg、Zn、Mn 5个元素间也呈显著相关。