某父母代肉种鸡群泄殖腔拭子与环境样本中细菌分离鉴定及耐药性分析

张红波，葛福玲，褚琳琳，唐德宏

（1.山东省威海生态环境监测中心，山东 威海 264200；2.泰安市动物疫病预防控制中心，山东 泰安）

山东是我国肉鸡养殖大省，据统计，2020年全省肉鸡出栏量20.45亿只，占到全国40%，连续多年居全国首位。随着肉鸡养殖业的不断发展，家禽细菌病引起的鸡舍环境污染、禽产品食品安全与品质等养殖业的难题也伴随产生[1]。由病原微生物引起的食源性疾病已成为影响食品安全的重要问题[2-3]。

细菌病是肉鸡养殖中常见的疾病之一，大肠杆菌、奇异变形杆菌及肺炎克雷伯菌都属于重要的条件致病菌，且易与其他微生物造成混合感染或继发感染，给养鸡业造成巨大的经济损失[2,4]。肉鸡大肠杆菌病是危害肉鸡养殖业的主要细菌病之一，大肠杆菌可导致禽的心包炎、卵黄性腹膜炎，且血清型众多，加之养殖场抗生素的不合理使用甚至滥用，造成耐药菌株和多重耐药菌株的产生[4-6]，引起人们的广泛重视。本研究从山东省某父母代肉种鸡养殖场采集环境样品和19日龄鸡只的泄殖腔拭子样品，通过细菌的分离鉴定，以及对增菌液的药敏试验，分析其抗药性，以期为该养鸡场中抗生素的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质控菌株 大肠杆菌标准质控菌株（ATC C 25922）购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 主要试剂与仪器 缓冲蛋白胨水（BPW）、LB固体培养基、LB液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）购自青岛高科园海博生物技术有限公司；肠道致病性大肠埃希氏菌血清诊断试剂盒（国药准字S20063056）购自天润生物药业有限公司；复方新诺明、四环素、庆大霉素、链霉素、氨苄西林、氧氟沙星、加替沙星、头孢西丁、头孢他啶、阿莫西林、多西环素均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。布鲁克全自动快速生物质谱检测仪购于MBT公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 选取山东某规模化父母代肉种鸡养殖场，使用无菌棉棒与纱布采集水线乳头样品5份，饲料样品5份，垫料样品5份和19日龄鸡只泄殖腔拭子56份样本，共计71份样品，将拭子样品放进含有BPW增菌液的灭菌离心管中备用。

1.2.2 细菌的分离鉴定 无菌条件下将样品经BPW培养基增菌培养20 h，以三线法划线于LB固体培养基，培养18~24 h后，在每个细菌平皿上选择形态、特性不同的单菌落用微生物质谱检测仪鉴定。

1.2.3 血清型鉴定 选取微生物质谱仪鉴定为大肠杆菌的菌落进一步纯化到XLD平板上，37 ℃恒温培养24 h，使用肠道致病性大肠埃希氏菌血清诊断试剂盒进行血清型鉴定。

1.2.4 药敏试验 从56份泄殖腔拭子样品中随机选取10个样品，经BPW增菌20 h后，使用复方新诺明等11种抗菌药物对BPW增菌液进行抗生物敏感性检测，大肠杆菌ATCC25922用作质控菌株。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定

根据细菌在LB固体培养基上的生长特性和菌落形态，结合微生物质谱仪最终鉴定出85株细菌（表1），包括大肠杆菌，奇异变形杆菌，肺炎克雷伯菌，溶血葡萄球菌，粪产碱杆菌，球形赖氨酸芽孢杆菌，解鸟氨酸拉乌尔菌，逊德勒氏不动杆菌，粪肠球菌，嗜麦芽窄食（寡养）单胞菌等10种细菌。

表1 细菌分离鉴定结果汇总表

2.2 血清型鉴定

通过对鉴定出的49株大肠杆菌进行血清型鉴定，发现其中有5株鉴定为肠道致病性大肠杆菌，O44和O86是其主要流行的血清型（表2）；其余44株为非肠道致病性大肠杆菌。

表2 5株肠道致病性大肠杆菌血清型鉴定结果

2.3 药敏试验结果

10份拭子样品的药敏试验结果见表3。结果显示，10份拭子样品对复方新诺明、四环素、氨苄西林、头孢他啶和多西环素的耐药率均为100 %；其次为链霉素、阿莫西林和氧氟沙星，耐药率分别为90 %、90 % 和80 %，对加替沙星和庆大霉素的耐药率分别为50 % 和10 %。

表3 泄殖腔拭子样品增菌液药敏试验结果

3 讨论与结论

从山东省某肉鸡养殖场采集的71份环境与鸡只泄殖腔拭子样品，经过增菌后分离纯化、形态学观察与微生物质谱鉴定，共获得85株细菌，包含10个种，其中以大肠杆菌（57.65 %）、肺炎克雷伯菌（25.88 %）为优势菌，这两种细菌均为条件致病菌，血清型鉴定结果显示，5株大肠杆菌为肠道致病性大肠杆菌，关于其对肉鸡致病力的影响，具体等待进一步的研究。

由于抗生素的大量使用甚至滥用，导致细菌对抗生素的耐药性不断增加，耐药谱越来越广[7-9]。本研究结果显示，鸡群对复方新诺明、四环素、氨苄西林等9种抗生素耐药性较为严重，均高于80 %，这一结果与李明举等人2018年从烟台和威海鸡场采集样品，对分离到的169株大肠杆菌进行耐药性检测的结果相似[10]。结果表明，该养鸡场细菌耐药性非常严重，提示临床用药需要合理使用抗生素，并对鸡群耐药情况持续进行监测以防细菌耐药问题的进一步加剧。