卒中后抑郁患者外周血miR-23a和miR-378表达对其诊断价值*

卒中后抑郁(Post-Stroke Depression, PSD)是脑卒中后最常见的并发症之一[1]。卒中后抑郁可在缺血卒中后2周内发生，即早发型PSD，可持续数月甚至数年。根据不同的研究对象、评价标准和发病时间，PSD的患病率从25%到70%不等[2～4]。研究表明，PSD与脑卒中患者神经功能恢复差、复发率高、病死率高有关[2, 3]，因此，及时诊断和治疗PSD对其预后有重要意义。然而，PSD的发病机制尚不清楚。目前，有关PSD的假说主要有神经解剖学、神经生物化学和神经遗传学等。尽管学者认为PSD的发病机制不同，推测PSD可能是多种机制共同作用的结果，临床因素和血液标志物的结合可能是预测早发型PSD的潜在方法。microRNA(miRNA或miRs)是一类小的非编码RNA，主要参与基因转录后调控表达，包括调节肿瘤的发生发展、炎症反应等[5～7]，此外有研究发现miRNA在抑郁症等精神疾病中发挥关键作用[8]。有研究报道，miR-140-5p是迟发型PSD的独立危险因素，miR-140-5p对迟发型PSD的预测具有较好的敏感性和特异性，miR-140-5p可能参与了迟发型PSD的发病机制，有望作为一种新的早期预警生物标志物[9]。此外，重度抑郁症患者体内let-7b、let-7c、miR-1202、miR-124-3p表达水平显著改变，PSD患者体内 miR-137、miR-92a-3p、miR-211和miR-300表达水平亦显著改变[10～12]。越来越多的证据表明，循环miRNAs可以作为疾病状态、特征的潜在生物标志物，或者可以作为抑郁症治疗的潜在靶点。研究发现，miR-23a和miR-378水平的升高主要参与肿瘤的生长侵袭、转移与炎症反应调控[13～16]，但目前尚无有关miR-23a和miR-378水平变化与PSD的研究。本研究主要探讨PSD患者血清中miR-23a和miR-378的表达水平，并分析其对PSD的诊断及预后评估的作用。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2018年3月～2021年8月深圳市康宁医院和湖南省脑科医院收治的128例脑卒中患者。其中男72例，女56例；年龄37～82岁，平均(60.59±12.06)岁，中位数年龄62岁。依据住院及随访时间内患者是否发生PSD症状分为PSD组(48例)和非PSD组(80例)。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)经头颅磁共振成像(MRI)诊断为脑卒中；(3)首次发病，12 h内入院；(4)PSD诊断符合《ICD-10精神与行为障碍分类》诊断标准，同时由2名受过量表评估培训的精神疾病专科医生对所有患者进行17项汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale-17，HAMD-17)评估，HAMD-17≥7分为抑郁症；(5)能够配合完成量表评估及临床资料完整；(6)签署患者知情同意书。排除标准：(1)发病之前有抑郁症等精神症状；(2)有认知、意识障碍疾病；(3)服用精神药物史；(4)合并心、脑、肝、肾等慢性病史；(5)病例失访。

1.2 方法

1.2.1 试剂和材料 无水乙醇、氯仿和异丙醇等购自德源化工公司，TRIzol购自武汉谷歌生物公司，逆转录试剂和荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司，U6内参、miR-23a和miR-378引物购自广州锐博生物公司。

1.2.2 逆转录-聚合酶链反应检测患者血清中miR-23a和miR-378的表达 所有患者均于入院次日清晨采集空腹静脉血10 ml，3 000rpm离心10 min，取上层血清用于试验。向上述血清中先后加入TRIzol，氯仿和异丙醇等提取总的RNA。采用RT-qPCR检测将RNA逆转录为cDNA进行扩增。反应条件如下：加热 95 ℃， 时间30 min，变性 94 ℃，时间15 s， 退火55 ℃，时间 30 s， 延伸70 ℃，时间30 s，共 40个循环。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，以U6为内参， 采用2-△△Ct法计算miR-23a和miR-378相对表达量。miR-23a引物：上游：5’-GCCGATCACATTGCCAGGG-3’，下游：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-378引物：上游：5’-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3’，下游：5’-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3’；U6 内参：上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.3 随访 由医生采用电话回访和门诊复诊相结合方式随访患者预后情况，随访开始诊断为脑卒中确诊时间，随访截止时间为2021年8月发病后1年，发生PSD即为终点事件。随访内容主要为参考《ICD-10精神与行为障碍分类》诊断标准和HAMD-17。

1.2.4 观察指标 患者的一般临床资料包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病史、心脏病史及体质量指数(BMI)等。实验室指标包括患者入院次日清晨空腹血液送检的白细胞计数(WBC)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及空腹血糖等实验室检查。脑卒中患者TOAST病因分型、梗死灶位置及入院时美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS) 评分结果。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、心脏病史、吸烟史、饮酒史、BMI、实验室检查、梗死灶位置、TOSAT分型比较差异均无统计学意义(P>0.05)，PSD组NIHSS评分高于非PSD组(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料及实验室检查比较

2.2 两组血清中miR-23a和miR-378相对表达量 PSD组血清miR-23a的相对表达量(2.15±0.97)高于非PSD组(1.18±0.64)(t=9.95，P<0.01)。PSD组血清miR-378的相对表达量(1.38±0.32)高于非PSD组(1.06±0.12)(t=3.06，P<0.05)。见图1。

注：*P<0.05,**P<0.01

2.3 影响卒中患者发生抑郁的危险因素 单因素分析结果显示NIHSS评分增高、miR-23a和miR-378升高是影响卒中患者发生抑郁的危险因素(P<0.05)。见表1，图1。多因素Logistic回归分析显示NIHSS评分增高、miR-23a和miR-378升高是影响卒中患者发生抑郁的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 卒中后发生抑郁的多因素Logistic回归分析

2.4 PSD患者外周血miR-23a和miR-378对PSD患者发病诊断价值 ROC曲线分析结果显示，PSD患者血清中miR-23a的曲线下面积为0.907(95%CI：0.859～0.955，P<0.000 1)，最佳诊断为1.81，特异性为0.938，敏感性为0.725。PSD患者血清中miR-378的曲线下面积为0.835(95%CI：0.766～0.903，P<0.000 1)，最佳诊断为1.51，特异性为0.896，敏感性为0.600。见图2。

图2 PSD患者外周血miR-23a和miR-378表达水平诊断PSD的ROC曲线

3 讨论

卒中目前是全球第三大死亡原因，也是老年人口的主要健康问题，不仅会导致残疾等身体损伤，还会导致社交与心理疾病[1, 17]。其中，PSD是最常见的神经精神损伤，常伴有冷漠、疲劳、自我感觉价值低、睡眠改变和快感缺失，PSD是导致卒中患者生活质量低下的最重要因素[18, 19]。然而，迄今为止，PSD的发病机制尚不清楚。研究表明PSD可能与解剖学、神经生物学、遗传因素和社会因素有关[1]。研究表明脑额皮层下回路(FSC)和脑边缘-皮质-纹状体-苍白球丘脑回路(LCSPTC)与脑卒中后抑郁的发生有关[20, 21]。脑卒中后，机体释放大量炎症因子进而影响下丘脑-垂体-肾上腺轴功能。在细胞中，5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)和去甲肾上腺素的表达水平降低，从而导致抑郁的发生[22]。此外，有报道称5-HT转运体编码SLC6A4基因[23]和脑源性神经营养因子(BDNF)Val66Met基因多态性[24]与PSD相关。

早期识别PSD的相关危险因素并对其进行预测对PSD患者预后具有重要意义。一些生物学标志物如DA、5-HT、炎症因子等与抑郁症相关。然而，仍缺乏PSD患者的临床预测因素。近年来，研究发现miRNAs与脑卒中发病率之间存在密切关系。例如，miR-124、miR-140-5p、miR-210和其他miRNAs已被确定为潜在的重要角色。此外，先前的研究也表明，异常表达的miRNA可能促进或诱导PSD的发生，并可能促进PSD的进展。研究者发现卒中患者的血清miR-223-3p 相对表达量降低及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平升高是 PSD 发病的独立危险因素，早期将两指标联合检测可有效预测PSD的发病[25]。此外，研究结果表明，miR-140-5p在PSD中上调，受试者ROC曲线显示，miR-140-5p预测迟发型PSD的发生，最高敏感性为83.3%，特异度为72.6%[9]。

本研究结果显示，两组性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、心脏病史、吸烟史、饮酒史、BMI、实验室检查、梗死灶位置、TOSAT分型比较差异均无统计学意义，PSD组NIHSS评分高于非PSD组，这与其他研究结果一致[26]。PSD组血清中miR-23a和miR-378的相对表达量高于非PSD组，多因素Logistic回归分析显示NIHSS评分增高、miR-23a和miR-378升高是影响卒中患者发生抑郁的独立危险因素，提示miR-23a和miR-378可能参与PSD的发病。本研究还采用ROC曲线分析了miR-23a和miR-378对卒中患者PSD发病的诊断价值。结果发现血清miR-23a和miR-378诊断PSD时ROC的曲线下面积分别为0.907和 0.835，提示miR-23a和miR-378对PSD具有较高的诊断价值，可作为血清标志物筛查PSD。

综上所述，本研究结果提示PSD患者血清中miR-23a和miR-378表达升高是PSD发病的独立危险因素，同时对PSD的诊断也具有一定的价值，有望作为PSD早期诊断的潜在分子标志物。