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FOLFOX耐药相关基因是预测结肠癌患者预后的潜在生物标志物

2022-09-20陈曙冉吴华彰刘牧林

重庆医学 2022年17期
关键词:分型结肠癌耐药

陈曙冉,董 锐,吴华彰,刘牧林,△

(1.蚌埠医学院第一附属医院胃肠外科,安徽蚌埠 233000;2.蚌埠医学院生命科学学院癌症转化医学安徽省重点实验室,安徽蚌埠 233000)

全球癌症报告显示,结直肠癌已成为癌症死亡的第二大常见原因,且发病年龄逐渐趋向于年轻化[1-3]。失去手术机会的结肠癌患者,在不进行治疗的情况下,平均寿命仅为8个月[4]。化疗已广泛应用于晚期结肠癌患者的治疗,其中FOLFOX方案是目前结肠癌的临床一线化疗手段,该方案的化疗用药包括亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂[5-6]。然而由于耐药的形成,即使经过合理的治疗,结肠癌患者5年生存率也相对较低[7-8]。因此,发现新的与FOLFOX化疗方案耐药的机制显得格外重要。免疫治疗在实体肿瘤的治疗中发挥着越来越大的作用[9-10],多项研究表明,FOLFOX化疗方案对结肠癌患者体内的免疫微环境有重塑作用[11-13]。为探究FOLFOX化疗方案耐药与免疫微环境的关系,本研究对FOLFOX化疗方案敏感和耐药的患者的表达谱进行分析,基于随机森林树方法确定出耐药的核心基因。使用耐药基因构建风险模型,评估高低风险与免疫浸润的关系,同时使用患者的临床病理转归与预后进一步探讨免疫对FOLFOX化疗患者的影响,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从GEO数据库中下载患者对FOLFOX化疗方案有反应情况的数据,使用“limma包”和“sva包”将数据集进行合并,对差异最显著的基因用热图进行可视化。从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载结肠癌患者的转录组和临床数据,从GEO数据库中下载含有患者生存状态的数据。

1.2 方法

1.2.1确定耐药核心基因

使用“radomForest包”分析差异基因中最有意义的基因作为耐药核心基因,在线网站Metascape对差异基因进行功能富集分析。使用“limma包”将患者按照耐药核心基因的表达水平进行聚类,使用“pheatmap包”对聚类结果进行可视化。

1.2.2分析耐药相关基因与药物敏感性和免疫微环境关系

基于耐药核心基因的表达谱,采用共识聚类算法对结肠癌患者进行分类,使用GSVA和ssGSEA分析耐药相关基因不同亚型间的差异。从CellMiner网站(https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do)下载转录组和药物敏感性数据。使用“imput包”补充药物敏感性数据中的缺失值,使用ggpubr包和ggplot2包分析耐药核心基因与药物敏感性关系。

1.2.3构建耐药核心基因预后模型

将样品分为train组和test组,使用train组样品构建预后模型,模型的公式为用于构建模型基因的表达水平乘以其对应的系数,随后使用test组对所构建的预后模型进行验证。使用lasso回归显著基因构建COX模型,根据基因表达水平及系数构建模型公式从而计算test组中各样品的风险得分。按风险得分中位值将样品分为高低风险两组,比较高低风险两组的预后及受试者工作特征(ROC)曲线。使用test组验证train组构建模型的准确性。

1.2.4风险得分与免疫微环境和耐药

使用CIBERSORT算法计算每个结肠癌标本中22个人免疫细胞亚群的分数。此外,还使用单标本基因集富集分析(ssGSEA)算法确定了结肠癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平。

1.2.5免疫组织化学染色

结肠癌组织与癌旁组织蜡块取自2021年蚌埠医学院第一附属医院接受手术治疗的4例结肠癌患者。将组织切片依次于二甲苯和无水乙醇浸泡,随后使用乙醇和蒸馏水脱蜡并进行封闭,4 ℃摇床过夜孵育一抗。磷酸盐缓冲液洗去表面残留一抗,并于二抗中室温孵育1 h,用DAB显色液对组织进行显色,最后脱水封片,分别在100×和200×视野下观察并拍照。一抗FABP4、FOXC1及二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 统计学处理

采用R4.1.0软件进行数据分析,计数资料以频数表示,两组间比较采用Wilcoxon秩和检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis检验;生存分析采用Kaplan-Meier法,采用Log-rank检验生存差异;相关性分析采用Pearson相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 获取结肠癌患者对FOLFOX化疗方案耐药相关基因

合并GSE28702和GSE69657数据集,对差异基因进行GO富集分析,这些基因大多富集在免疫相关信号通路。将免疫相关基因与本研究获取的耐药相关基因取交集,获得127个免疫相关耐药基因。使用随机森林树筛选耐药核心基因,显示耐药核心基因的表达水平能明显区分患者对FOLFOX化疗方案的敏感性,见图1。

2.2 耐药相关基因分型及分型与免疫浸润关系

采用共识聚类算法将结肠癌患者分为两个亚型。PCA分析显示,耐药亚型能明显将患者分为两群。GSVA富集分析发现,不同分型下差异通路主要体现在免疫相关通路。ssGSEA分析表明,多数免疫细胞在分型B中的浸润程度明显高于分型A,见图2。

A:耐药相关差异基因的GO富集分析;B:耐药相关差异基因与免疫相关基因的交集基因;C、D:随机森林树筛选耐药相关核心基因;E:耐药相关核心基因与患者对FOLFOX化疗方案的反应性关系。

A:耐药相关核心基因分型;B:分型的PCA图;C:分型间免疫细胞浸润差异;D:分型间的功能差异。

2.3 耐药相关基因与药物敏感性关系

多数耐药核心基因与FOLFOX4化疗方案中的主要成分氟尿嘧啶和奥沙利铂的敏感性具有相关性。此外,耐药核心基因的表达水平与多种化疗及靶向治疗药物的耐药性存在正相关,见图3。

2.4 耐药基因分型的风险模型构建

LASSO-Cox回归分析进一步筛选候选预后相关的基因,生存分析表明高危组的总生存期明显低于低危组,1、3和5年的曲线下面积(AUC)分别为0.840、0.801和0.736,见图4。

A:耐药相关基因与FOLFOX化疗方案敏感性关系;B:耐药相关基因与药物敏感性关系。

2.5 预后风险模型及临床特征评估

单变量Cox回归分析中,风险得分的HR=1.175,95%CI:1.130~1.222(P<0.001);在多变量Cox回归分析中,HR=1.103,95%CI:1.055~1.153(P<0.001)。随着时间的增加,风险得分的一致性指数和ROC曲线表明风险模型比传统临床风险因素(TNM分期)在预测患者转归的能力上有更好的灵敏度和特异度。随着肿瘤TNM分期的增高,患者风险得分也在增高。此外,在T分期为3~4期,N分期为1~2期及M分期为0期的患者中,高风险患者预后明显较差,见图5。

2.6 风险模型与结肠癌的免疫微环境

风险基因的表达与结肠癌患者免疫微环境中多种免疫细胞,包括中性粒细胞、T细胞及巨噬细胞等的浸润程度密切相关。同时,风险基因与PDCD1、CD274及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)这些免疫检查点也具有共表达关系。此外,多数免疫检查点基因的表达水平,如CD86、CD40及CD70等在高风险组患者表达增高。最后,HPA数据库及患者标本的免疫组织化学结果显示,高风险基因在结肠癌组织中的表达更高,见图6。

A:预后风险模型的构建;B~D:风险得分和患者生存状况的散点排列图,高危和低危患者分别用红点和蓝点表示;E:高低风险间总生存期的Kaplan-Meier分析;F:根据风险得分预测1、3、5年生存率的灵敏度和特异度的ROC曲线。

A:临床特征和风险等级与OS的单变量和多变量分析;B:风险等级和临床特征的一致性指标;C:临床特征和风险等级的ROC曲线;D:风险等级与不同TNM分期的关系;E:不同临床性状在高低风险等级下的预后。

A:风险模型基因与免疫细胞含量的相关性;B:风险模型基因与免疫检查点的共表达关系;C:高低风险组模型基因的表达;D:风险模型基因在结肠癌及癌旁组织的表达情况(DAB染色)。

3 讨 论

FOLFOX化疗方案是转移性结肠癌患者最常用的一线化疗方案之一,但患者在经该方案治疗后客观有效缓解率仅50%[14]。考虑到化疗本身对患者和社会带来的巨大负担,寻找能预测患者对FOLFOX化疗方案灵敏的生物标志物是一个十分重要且急需解决的问题[15]。化疗药物的种类繁多,起到的作用也不尽相同。不同的化疗药物作用于不同种的肿瘤产生的耐药机制也不同,而多药耐药是临床上更加棘手的一个问题[16]。因此,本研究首先确定了结肠癌患者对FOLFOX4化疗方案耐药的关键基因,根据关键基因的表达水平对样品进行分型,获取分型的差异基因构建结肠癌的风险模型。结果显示,该模型对患者的临床病理特征及预后均具有较好的预测意义,且该模型与免疫微环境密切相关。

近来多项研究表明,化疗联合抗肿瘤免疫能大大提高对肿瘤的疗效。游离氟尿嘧啶给药同时联合抗肿瘤免疫能明显抑制原位结肠腺癌小鼠模型中肿瘤的生长[17]。一项临床随机Ⅱ期研究表明,在使用免疫检查点抑制剂同时加用细胞毒性药物是治疗转移性结肠癌的前期有效策略[18]。一项临床回顾性研究表明,即使在免疫难治性微卫星稳定的转移性结肠癌患者中,化疗前施用免疫检查点抑制剂也可增强细胞毒性作用[19]。这表明在化疗同时辅以免疫治疗能提高患者的化疗效果,本研究确定的耐药核心基因可能对化疗联合免疫治疗的时机提供一定的指导意义。

免疫微环境包括多种免疫细胞及免疫因子[20]。目前,CTLA4在免疫治疗中占据着越来越重要的作用[21-23]。最近一项成果也与本研究相互佐证[24]。此外,一项关于将抗CTLA4联合FOLFOX治疗转移性结直肠癌患者二期临床研究也正在开展之中[25]。FOLFOX耐药相关基因构建的模型中CTLA4在高风险组中表达降低,推测FOLFOX耐药可能与T细胞介导的免疫状态改变密切相关。

本研究还发现,高风险组与CD8+T细胞及肿瘤相关成纤维细胞的表达呈正相关。T细胞在抗肿瘤免疫中发挥了极其重要的作用,近年来嵌合抗原受体的T细胞治疗方法让血液系统恶性疾病患者受益匪浅,同时在实体肿瘤的治疗上,该方案也发挥着越来越大的作用[26-28]。肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤耐药密切相关[29],其能通过促进癌症干细胞的分化,分泌多种细胞因子,甚至是物理因素等促进肿瘤的发展[30-32]。

综上所述,T细胞和肿瘤相关成纤维细胞的增高可能是高风险患者预后更差的原因。但本研究存在以下问题:(1)分析的数据中样本量较少且均是回顾性数据,因此,需要更大样本量、更详细临床数据及合理的前瞻性研究来验证。(2)未进行较为详尽的细胞、动物实验和临床试验,因此,后期需要更详尽的数据来佐证。

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