雷公藤内酯醇逆转卵巢肿瘤微环境的体内实验研究

陈燕晶 杨丽兰 谭布珍 胡 辉

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌，但死亡率却居妇科肿瘤首位，严重威胁女性生命和健康[1]。卵巢癌诊断时大部分有腹盆腔转移，确诊时多属中晚期，卵巢癌浸润、转移是造成卵巢癌治疗困难的主要原因[2]。肿瘤细胞耐药的发生和化疗药物产生的不良反应严重影响着其治疗效果，甚至导致化疗失败、肿瘤复发[3]。尽管最近在手术和化疗方面取得了进展，但总的来说卵巢癌患者5年生存率仅为40%[4]。为了提高卵巢癌的诊断和治疗水平，有必要进一步了解卵巢癌发病的分子机制。大量研究表明，肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和耐药机制复杂[5-10]。

从天然产物中寻找抗肿瘤活性成分是发展抗肿瘤药物的重要策略之一，雷公藤是我国一种资源比较丰富的传统中草药，其结构多样，有效成分具有明显的抗炎、免疫抑制和抗肿瘤等作用。雷公藤内酯醇(TP)作为最著名的天然产物之一，长期以来在中国被用作类风湿性关节炎的消炎药，也被认为是治疗各种癌症的潜在药物[11-17]，尽管有研究表明其对动物肝脏、肾脏、睾丸、卵巢和心脏有潜在毒性[18]。有研究表明，TP对各种癌症模型具有广泛的抗癌作用[19-24]。近年来随着对耐药性肿瘤研究的深入，大量研究证实，TP比传统抗肿瘤药物如紫杉醇、顺铂、多柔比星等具有更强的抗肿瘤活性[25]，且某些对传统药物耐药的肿瘤细胞，对雷公藤内酯醇却十分敏感。我们课题组长期以来一直研究雷公藤内酯醇对耐顺铂人上皮性卵巢癌的抑制作用，取得了一定的研究成果。本研究采用SKOV3细胞小鼠成瘤模型研究了TP的抗癌作用，并通过分析肿瘤微环境相关细胞因子及蛋白表达的改变研究TP的抗癌作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及动物

SKOV3细胞(购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库)；BALB/c-nu小鼠6只(生产厂家：湖南斯莱克景达实验动物有限公司；许可证号SCXK(湘)2016-0002)

1.2 实验试剂与仪器

DMEM完全高糖培养液(凯基生物 KGM12800S-500)；雷公藤内酯醇(ST8290Solarbio)；TUNEL检测试剂盒(C1088，碧云天)；RIPA细胞裂解液(C1053，北京普利莱基因技术有限公司)；PVDF膜(IPVH00010，Millipore)；超敏发光液(RJ239676，赛默飞)；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(TA-08，中杉金桥，1/2000)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金桥,1/2000)；Rabbit Polyclonal Anti-BDNF ((DF6387，Affinity，1/1000)；Rabbit Polyclonal Anti-TrkB (AF6461，Affinity，1/1000)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金桥，1/2000)；酶标仪(RT-6100，Rayto)；蛋白垂直电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)；超高灵敏度化学发光成像系统(Chemi DocTM XRS+，伯乐生命医学产品(上海)有限公司)；显微镜(CX41 OLYMPUS)。

1.3 细胞培养

收集细胞后，弃去培养上清，1×PBS洗两遍，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)在37 ℃培养箱中消化2 min，加入培养基终止消化并悬起细胞；收集细胞至10 ml离心管中，1000 rpm离心3 min，弃尽上清，加入培养基吸管吹匀；将上述细胞悬液稀释至适宜细胞密度后加入准备好的培养皿中，置于37℃5% CO2培养箱中培养。

1.4 裸鼠成瘤

每只Balb/c-nu小鼠均进行右侧腋下皮下注射接种SKOV3细胞5×106个，每2天测量一次裸鼠体重并使用游标卡尺测量裸鼠的肿瘤大小，当肿瘤长到5 mm左右时开始腹腔注射给药。

1.5 实验分组

SKOV3组：每只裸鼠按0.15 ml/10 g剂量腹腔注射生理盐水。1次/天，连续给药14天；SKOV3+雷公藤内酯醇(8 ng/ml)组：每只裸鼠按0.15 ml/10 g剂量腹腔注射10 μg/ml的雷公藤内酯醇注射液，1次/天，连续给药14天。外周血取样：摘眼球法取血，静置后离心取上清用于ELISA检测；处死：裸鼠颈椎脱臼处死；切开瘤体处皮肤，暴露皮下组织并仔细观察瘤体；用手术剪与手术镊分离瘤体与周边组织，将肿瘤完整剥离；将取下的瘤体用电子天平称重并记录，用游标卡尺测瘤体大小，记录并拍照实验数据；将取下的瘤体一部分置于10%甲醛溶液内固定并存放于4 ℃冰箱内。用于HE、免疫组化、TUNEL检测。剩余的部分用于WB检测。ELISA检测、WESTERN-blot检测、TUNEL染色检测凋亡、HE染色及免疫组化均按试剂盒步骤操作。

1.6 统计学分析

所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析，经t检验判定显著性差异，以P<0.05作为显著性差异(P<0.05)。

2 结果

2.1 成瘤大小

表1可见，SKOV3+TP组成瘤体积大小明显小于SKOV3组成瘤体积大小(P<0.05)。

表1 2组成瘤体积大小比较

2.2 血清IL-2、HIF-1α、TNF-α和CSF-1比较

加入TP干预后，SKOV3+TP组中血清IL-2及TNF-α都明显高于SKOV3组，两者之间差异有统计学意义(P<0.05)；而SKOV3+TP组中血清HIF-1α及CSF-1都明显低于SKOV3，两者之间差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

图1 2组中各细胞因子的比较

2.3 肿瘤凋亡检测

如表2所示，SKOV3+TP组细胞凋亡数明显多于SKOV3组(P<0.05)。

表2 2组细胞凋亡数比较

2.4 2组HE染色及免疫组化

HE染色可见细胞异型性，核浆比增高，存在巨核和多核改变。表3可见：SKOV3组MMP-2中肿瘤细胞绝大部分胞浆呈棕黄色，阳性率达100%；SKOV3+TP组MMP-2中肿瘤细胞部分胞浆呈淡黄色，阳性率为16.7%。表4可见：SKOV3组VEGF-1中肿瘤细胞绝大部分胞浆呈棕黄色，阳性率达100%，SKOV3+TP组VEGF-1中肿瘤细胞部分胞浆呈淡黄色，阳性率为0%。

表3 2组MMP-2蛋白表达阳性率比较

表4 2组VEGF-1蛋白表达阳性率比较

2.5 2组MMP-2 和VEGF-1蛋白表达的差异

如图2所示：TP作用后，肿瘤组织中MMP-2及VEGF-1蛋白表达明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)

图2 2组MPP-2 和VEGF-1蛋白表达情况

3 讨论

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统恶性肿瘤，其病理类型众多，以上皮性最为常见。顺铂在发挥抗肿瘤效用的同时，激活了细胞内抗凋亡通路，从而削弱了癌细胞对顺铂的敏感性，成为顺铂充分发挥其抗肿瘤效用的绊脚石[26]。雷公藤内酯醇作为一种著名的植物化学物质，通过抑制肿瘤细胞的增殖和诱导多种肿瘤的凋亡来实现其多效性抗癌活性[27]。TP在体内外均具有抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡的作用。TP还被证实在诱导耐药多发性骨髓瘤和宫颈癌细胞凋亡方面有效[28]。我们前期工作发现TP对耐顺铂上皮性卵巢癌的抑制作用机制[29-33]，主要研究了TP作用于凋亡信号通路抑制肿瘤细胞的生长。本研究围绕肿瘤微环境，通过体内裸鼠成瘤实验发现，TP可以抑制SKOV3细胞肿瘤大小，通过改变肿瘤微环境，促进肿瘤发生凋亡。

CSF-1是具有多种生物学功能的细胞因子，有多种细胞可以产生CSF-1，它能刺激单核吞噬细胞家族的增殖、分化与存活，CSF-1的主要功能之一就是刺激巨噬细胞的分化和生长[34]。有研究表明，CSF-1在许多恶性肿瘤中异常高表达[35]。CSF-1在卵巢癌中是高表达的[36]。由于肿瘤细胞周围存在局部缺氧环境，因此肿瘤细胞需要通过基因表达的改变，如上调缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)激活细胞增殖，促进血管新生和下调细胞凋亡水平适应整个肿瘤微环境的变化，使其在缺氧条件下继续存活甚至进行增殖。随着研究的不断深入，监测肿瘤组织中HIF-1α和血管内皮生长因子VEGF的表达辅助卵巢癌的早期诊断和预测其侵袭性，已受到越来越多的关注[37]。细胞因子是由免疫系统细胞以及其他多种类型的细胞分泌的一类小分子蛋白质，包括淋巴因子、干扰素(IFN)、IL、TNF和集落刺激因子等。有研究已证实IL诱导NO合成是其抗肿瘤作用的机制之一，不仅IL能作用于肿瘤细胞发挥作用，其他类别的IL也能参与到肿瘤细胞的进展机制中[38]。TNF主要是由活化的单核或巨噬细胞产生，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性 粒细胞聚集吞噬，可引起卵巢表面上皮细胞生长，降低卵巢癌细胞生长，可使约40%的肿瘤MHC-I、肿瘤抗原提呈蛋白表达增强[39]。本研究实验结果表明，通过加入TP后会引起SKOV3肿瘤血清中的IL-2及TNF-α上升，血清HIF-1α和CSF-1下降，从而影响了肿瘤的生长。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是参与降解全身各种组织细胞外基质(extra-cellularmatrix，ECM)的蛋白酶家族。MMP-2在肿瘤的血管化、肿瘤细胞的侵袭和转移灶的形成过程起重要作用。MMP-2具有降解血管基底膜中的胶原的能力，与肿瘤新生血管形成和生理条件下及病理条件下肿瘤转移等有关。MMP-2的表达和活性水平的改变与多种癌症的转移密切相关。有研究表明，雷公藤内酯醇会抑制肿瘤细胞MMP-2的表达[40-46]，其中众多的生长因子参与了肿瘤生理病理血管的生成过程，尤其是血管内皮生长因子(VEGF)的调控作用最为重要[47]。有研究表明，VEGF在卵巢癌组织中是高表达，且高表达 VEGF的卵巢癌更易发生腹膜转移。VEGF是促进增殖、迁移和毛细血管生长的关键血管生成因子[48-49]。本研究实验结果表明，通过加入TP后会引起SKOV3肿瘤组织中的MMP-2和VEGF表达下降，这结果说明TP可能是通过抑制MMP-2和VEGF表达，从而影响了肿瘤的生长，诱导凋亡发生。

综上所述，雷公藤内酯醇具有显著抑制人上皮性卵巢癌细胞SKOV3的增殖，并诱导其凋亡的作用。TP作用SKOV3细胞株后，血清CSF-1、HIF-1α和组织中MMP-2和VEGF表达会下降，通过上调血清IL-2及TNF-α表达，改变肿瘤微环境，从而影响肿瘤细胞的生长，最终诱导肿瘤发生凋亡。