HuR胞浆表达水平与接受他莫昔芬辅助治疗的雌激素受体阳性乳腺癌预后的相关性

廖瑜倩 李 勇 张战民 谢 宁 樊 英

根据2020年全球癌症统计数据，乳腺癌发病率位于所有恶性肿瘤发病率第一位，年新发病例数为2261419例[1]。在中国，乳腺癌发病率位于女性恶性肿瘤第1位[2]。2013年St Gallen会议提出了分子亚型的替代分型，即采用免疫组化雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、Ki-67表达情况进行分型[3]，其中激素受体阳性患者约占全部乳腺癌患者的70%[4]，提高这部分患者的疗效，对于改善整个乳腺癌患者人群的生存具有重要意义。

内分泌治疗是激素受体阳性乳腺癌最重要的治疗手段之一，所有激素受体阳性乳腺癌均需要接受辅助内分泌治疗，无论淋巴结状态、HER2状态、年龄、月经状态如何[5]。他莫昔芬是绝经前女性最常用的内分泌治疗药物。与不进行辅助内分泌治疗的患者相比，接受他莫昔芬辅助治疗的淋巴结阴性乳腺癌患者的5年复发风险可降低12.5%，死亡风险可降低3.5%，淋巴结阳性乳腺癌患者的5年复发风险可降低17.3%，死亡风险可降低5.9%。随着随访时间的延长，10年复发和死亡风险降低的比例更高[6]。芳香化酶抑制剂[7]、延长内分泌治疗时间[8]、联合细胞周期依赖激酶4/6抑制剂(CDK4/6抑制剂)[9]可以进一步提高激素受体阳性乳腺癌患者的生存期。然而，尽管激素受体阳性乳腺癌是各个亚型中预后较好的，但是仍有30%～50%的患者出现复发转移。我们还需要进一步发现新的预后预测指标及新型治疗药物。

人类抗原R (human antigen R，HuR)是一种RNA结合蛋白，属于胚胎致死性异常视觉(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)基因家族成员。HuR能够在转录后水平调节癌基因和抑癌基因的表达，包括信使RNA(mRNA)运输、mRNA衰变和蛋白质翻译等等。HuR在不同恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[10]。HuR也与他莫昔芬[11]、吉西他滨[12]、紫杉类[13]等药物的敏感性相关。但是，HuR与乳腺癌特征及生存的关系尚不明确，本研究计划在接受他莫昔芬辅助内分泌治疗的雌激素受体阳性乳腺癌患者中，分析HuR 胞浆表达水平与生存的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2005年1月至2016年12月在中国医学科学院肿瘤医院接受他莫昔芬辅助内分泌治疗的Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者105例。所有患者均签署知情同意书。该研究获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的同意。根据美国癌症分期联合委员会(AJCC) 2010版进行分期[14]。仅有5例患者未接受术后辅助化疗，31例患者接受术后辅助放疗。所有患者均接受他莫昔芬内分泌治疗5年。

1.2 免疫组化方法及评分

ER、PR、HER-2状态的评价依据2010年美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理学家学会(CAP)标准[15-16]。采用鼠抗人HuR单克隆抗体 (3A2;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)。在室温(37°C)下，以1∶200的稀释度与HuR抗体孵育1小时。然后进行标准的两步过氧化物酶共轭聚合物技术(DAKO Envision kit，DAKO，Carpentia，CA，USA)。下一步，用二氨基联苯胺四氢氯化物溶液(DAB；Sigma，美国密苏里州圣路易斯)观察免疫染色。

由2位病理科医生盲法观察，半定量积分法判断结果。HuR阳性染色部位定位于细胞浆。用低倍镜和高倍镜观察切片，判断标准：观察肿瘤胞浆的染色强度，分为0～3级：0级(0分)，未着色，阴性；1级(1分)，浅黄色，弱阳性；2级(2分)，黄色，中度阳性；3级(3分)，棕黄色，强阳性。同时，每张切片选取5个典型高倍视野，在200倍下连续计数100个细胞，阳性细胞数小于5%者为0分；5%～25%计1分；26%～50%计2分；51%～75%计3分；76%～100%计4 分。两种积分相加，积分为0～1分，表示阴性(-)；2～3分，表示阳性(+)；4～5分，表示阳性(++)；6～7分，表示阳性(+++)。本研究中，-～+为HuR弱表达(图1a)，++～+++为HuR强表达(图1b)。

注：a为HuR胞浆弱表达；b为 HuR胞浆强表达。

1.3 统计学方法

生存期(OS，overall survival)指从确诊开始至因任何原因死亡或末次随访的时间。无病生存期(DFS，disease-free survival)指从确诊开始至出现任何部位复发转移的时间。采用SPSS 21.0统计软件。分类资料的两两比较采用卡方检验、或Fisher's 精确检验，生存分析采用Kaplan-Meier方法，组间比较应用Log-Rank 检验，预后分析采用COX风险比例回归模型。

2 结果

2.1 胞浆HuR表达水平与临床病理特征的相关性

HuR弱表达者81例(77.1%)，强表达者24例(22.9%)。患者中位年龄43岁(26～50岁)，均为绝经前。全组患者的临床病理特征见表1。分析HuR胞浆水平与临床病理特征的相关性，结果显示，HuR强表达与Ki-67增殖指数高显著相关(P=0.006)。见表1。

表1 胞浆HuR表达水平与临床病理特征的相关性

2.2 不同临床病理特征及胞浆HuR表达水平与患者生存的相关性

全组5年OS率为96.1%(101/105)，5年DFS率为82.9%(87/105)。单因素Kaplan-Meier生存分析(Log-rank检验)结果显示：对OS和DFS有显著影响的因素为Ki-67指数、HuR表达水平，见表2。COX多因素预后分析显示，腋窝淋巴结转移状态、Ki-67指数、HuR表达水平是独立的预后因素，见表3。

表2 不同临床病理特征及胞浆HuR表达水平患者的5年DFS及OS分析

表3 COX多因素分析结果

3 讨论

HuR是一种RNA结合蛋白，在人体组织内广泛表达。HuR主要定位于细胞核，当受到细胞因子、低氧等刺激时，可从细胞核穿梭至细胞质。胞质内HuR通过RNA识别模体(RRMs)与靶基因mRNA 3'UTR的富含AU的元件(AREs)相结合，从而增加mRNA的稳定性，增强靶基因的表达。HuR可影响多种癌基因、抑癌基因的表达，胞浆内HuR水平的升高与乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的发生、发展相关[17]。此外，也有报道显示HuR表达水平与他莫昔芬敏感性相关。但是HuR对乳腺癌预后的影响结果仍不一致。本研究首次在接受他莫昔芬辅助治疗的绝经前、雌激素受体阳性乳腺癌患者中证实HuR强表达与Ki-67增殖指数高相关，HuR强表达患者预后不佳。

既往研究中，HuR表达水平与乳腺癌患者预后的关系不一致。Giaginis等的研究发现HuR高表达与肿块大、分期晚、ER阴性相关，且HuR高表达的患者总生存期和无病生存期更短[18]。另外还有四项研究也分别在208例浸润性乳腺癌、125例浸润性乳腺癌、139例接受紫杉醇联合蒽环新辅助治疗的乳腺癌患者、525例非-BRCA1/2突变乳腺癌患者中证实，HuR高表达与肿瘤侵袭性高、预后不佳相关[13,19-21]。以上五项研究的结果与我们的研究结果是一致的，提示HuR胞浆表达水平越高，肿瘤侵袭性越强，乳腺癌患者预后越差。但是也有研究得出相反的结果。在Ortega 的研究中[22]，HuR mRNA 表达水平越低，早期乳腺癌患者疾病复发风险越高。Yuan的研究也证实，预后差以及出现转移并死于乳腺癌的患者，HuR转录水平更低[23]。分析这些研究结果的不一致性，发现原因可能包括以下方面：首先，前5项研究以及我们的研究检测的是HuR蛋白水平，而后两项研究检测的是HuR mRNA水平，转录后水平的调控可能导致结果不一致；其次，检测蛋白或mRNA的抗体不同可能导致结果不同；最后，通过分析这些研究中入组的乳腺癌患者的基本特征，我们发现在前5项证实HuR表达水平高预示预后差的研究中，激素受体阳性患者所占的比例更高(超过60%)，而在后2项HuR表达水平高者生存期长的研究中，激素受体阴性患者居多。如Yuan的研究中雌激素受体阴性者占68%。可见HuR可能在不同分型的乳腺癌患者中具有不同作用。

事实上，已经有一些基础研究证实HuR在不同分型乳腺癌中发挥不同作用。在MCF-7细胞株中(激素受体阳性乳腺癌细胞株)，敲除HuR可导致cyclin D1下调，从而降低细胞生长。而在 MDA-MB-231细胞株中(三阴性乳腺癌细胞株)，敲除HuR可降低MMP-9水平，从而减弱细胞侵袭性但不影响细胞生长[24]。Gubin的研究也证实 HuR过表达可显著降低三阴性乳腺癌的肿瘤生长和肿瘤体积。他们发现HuR可通过影响三阴性乳腺癌的血管形成从而影响肿瘤生长[25]。然而，目前还没有HuR表达水平与不同分子分型临床患者预后的相关研究。我们的研究首次在激素受体阳性乳腺癌患者中证明，HuR胞浆高表达与激素受体阳性乳腺癌预后不佳相关。

由于我们入组的均为接受他莫昔芬治疗的患者，本研究结果也提示HuR胞浆水平高可能与他莫昔芬治疗不敏感相关。Hostetter以及Tan的研究支持我们的结果。前者在他莫昔芬敏感细胞株MCF-7以及他莫昔芬耐药细胞株BT474中证实，降低HuR胞浆表达水平可以提高细胞株对于他莫昔芬的敏感性[26]。Tan等在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞株中证实，miR26a/b与HuR的相互作用可以在转录后水平增加HER-2的表达，从而导致他莫昔芬耐药[11]。目前已有许多学者正在研究HuR相关治疗，今后有望通过这一手段逆转他莫昔芬的耐药，提高内分泌治疗的疗效。

综上所述，本研究中，HuR胞浆表达水平高与Ki-67增殖指数高相关，再次证实HuR胞浆表达水平高的肿瘤侵袭性强。此外，本研究首次在接受他莫昔芬辅助治疗的雌激素受体阳性乳腺癌患者中证实，HuR胞浆表达水平高与患者预后不佳相关，今后可能通过靶向HuR进一步提高他莫昔芬敏感性，改善患者生存。