HPLC测定化妆品中4种大麻酚类成分的检测方法

曹菲斐，丁雯倩，邬晓鸥，庞学斌，邱颖姮，王晓炜

(深圳市药品检验研究院，国家药品监督管理局化妆品监测评价重点实验室，广东 深圳 518057)

大麻(CannabissativaL.)是桑科大麻属植物，富含萜类、黄酮类、生物碱类等多种成分。大麻类提取物具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗菌作用，在化妆品中具有舒缓修复、抗老化、祛痘等功效[1]；大麻仁果、大麻籽油、大麻叶提取物曾收录于《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》中，目前市场上存在含大麻类成分的化妆品[2]。根据国家禁毒管理相关政策要求，2021年5月28日，国家药监局发布关于更新化妆品禁用原料目录的公告，将大麻二酚列为化妆品禁用原料、大麻仁果、大麻籽油、大麻叶提取物列为禁用植物原料。自公告发布之日起，化妆品注册人、备案人不得生产、进口产品配方中使用了上述原料的化妆品。

大麻中含有的大麻酚标志性化合物主要为Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC)、大麻二酚(Cannabidiol，CBD)和大麻酚(Cannabinol，CBN)，占大麻酚类化合物的90%以上[3]。其中Δ9-THC具有精神活性，可产生致幻及成瘾效果，被联合国列为“麻醉品”或“毒品”[4]，其在新鲜的大麻组织中主要以Δ9-四氢大麻酚酸A(Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A，Δ9-THCA-A)的形式存在，在干燥、陈化、加热或焚烧后THCA-A通过脱羧反应转化为THC，瑞士等欧洲国家已立法要求以游离的Δ9-THC及Δ9-THCA-A含量总和确定大麻原植物是否为毒品大麻[5]。在欧盟《化妆品法规 1223/2009》中，附录Ⅱ禁用组分列表包含大麻和大麻树脂与大麻浸膏和酊、四氢大麻酚、屈大麻酚、六氢大麻酚等物质；在加拿大化妆品限用组分清单中，收录的大麻来源原料限制要求四氢大麻酚含量应低于10 μg/g。

目前研究文献报道的大麻酚类化合物的检测主要针对大麻植物、大麻提取物及火麻仁油[6-12]，化妆品中大麻酚化合物的检测仅限于大麻二酚[13-14]，尚无化妆品中多种大麻酚类成分的检测研究。为全面监测化妆品中所含的大麻酚类化合物，本文建立HPLC法测定化妆品中Δ9-四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氢大麻酚酸A的方法，为进一步开展化妆品监测评价活动提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器设备

Alliance e2695-2998高效液相色谱仪，美国沃特世公司；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美国安捷伦公司；AG135电子天平(十万分之一)，瑞士梅特勒公司；KQ-250E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Synergy R System纯水器，默克密理博公司。

1.2 试剂与耗材

乙酸铵(色谱纯)，ACROS ORGANICS;磷酸二氢钾(分析纯)，阿拉丁公司；甲酸(色谱纯)，FLUKA公司；乙酸(色谱纯)，Avantor Performance Materrials；甲醇、乙腈(色谱纯)，默克公司；有机滤膜(0.45 μm疏水型)，津腾公司。Δ9-四氢大麻酚对照品溶液(100.0 μg/mL)、大麻二酚对照品溶液[(1.000±0.006) mg/mL]、大麻酚对照品溶液[(1.000±0.006) mg/mL]、Δ9-四氢大麻酚酸A对照品溶液[(1.000±0.006) mg/mL]：sigma公司;膏霜乳液、水剂、面膜、凝胶化妆品均为市售，标签标识含大麻(CANNABIS SATIVA)叶提取物、大麻(CANNABIS SATIVA)籽油等大麻成分。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

图1 4种组分高效液相色谱图Fig.1 HPLC diagram of 4 components

色谱柱：AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样体积10 μL；检测器：DAD检测器，检测波长220 nm及200～400 nm光谱扫描；以甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液(用乙酸调pH 6.0)(85:15)为流动相洗脱。此色谱条件下，4种组分分离良好，色谱图见图1所示。

1.3.2 供试品溶液的制备

取样品约1.0 g，精密称定，置于10 mL具塞比色管中，加入甲醇适量，涡旋振荡30 s，使试样与甲醇充分混匀；用甲醇定容至10 mL，超声提取20 min,摇匀，取上清液过滤，即得。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

实验选取了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸铵水溶液、甲醇-0.02 mol/L乙酸铵水溶液进行考察。当使用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，各组分分离度与峰型不佳；使用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸铵水溶液时，Alliance e2695-2998高效液相色谱仪在流动相平衡阶段、LC-20A高效液相色谱仪在进样阶段易出现失压现象；为避免上述情况的发生，故使用甲醇-0.02 mol/L乙酸铵水溶液作为流动相。流动相pH值的变化对Δ9-四氢大麻酚、大麻二酚和大麻酚的保留时间无显著影响，但对Δ9-四氢大麻酚酸的保留时间影响较大，当pH值为4.0和5.0时，四氢大麻酚酸与其余组分不能完全分离，pH值为6.0时分离良好。

2.2 线性与检出限、定量限

取1.2项下的各对照品溶液，用甲醇稀释得标准系列溶液并进行测定。以目标峰峰面积为Y，质量浓度(μg/mL)为X绘制标准曲线；以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定定量限, 线性范围、检出限、定量限结果见表1所示。

表1 4种线性范围、检出限与定量限Table 1 Linear ranges, correlation conefficients, LODs, and LOQs of 4 components

2.3 加样回收率试验与精密度

选取不含大麻成分的膏霜乳液、水剂、面膜、凝胶化妆品空白样品，分别添加浓度相当于约1、10倍LOQ的标准溶液，按2项下条件进行加标回收试验，每个水平平行测定6次，4种组分在样品中的平均加标回收率的范围为87.3%～111.1%，精密度均小于9.6%，详见表2所示。

表2 加标回收率试验结果Table 2 Results of standard addition recovery

续表2

2.4 实际样品测定

按本方法对11批标识含大麻成分的市售化妆品进行测定，结果4批样品检出大麻二酚，含量在0.04～1.5 mg/g之间；其余三种组分未检出，详见表3所示。

表3 样品分析结果Table 3 Analytical results of samples

3 结 论

本文建立了适用于不同化妆品基质的Δ9-四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氢大麻酚酸A的检测方法，能够基本覆盖使用大麻提取物原料的主要化妆品类型，操作简便、分离度好、灵敏度高、精密度良好，为监测化妆品中大麻类提取物的使用提供了技术参考。