白蛋白结合蛋白在肿瘤细胞中功能及抗肿瘤药物中应用的研究进展

2022-09-17曹阳高洁综述王辉翟丽丽审校

中国生物制品学杂志 2022年9期

曹阳，高洁综述，王辉，翟丽丽审校

华北制药集团新药研究开发有限责任公司抗体药物研制国家重点实验室，河北石家庄 052165

肿瘤细胞代谢活跃，需消耗大量能量和营养物质以满足自身的快速生长。有研究表明，肿瘤细胞是利用包浆蛋白提供营养物质，如白蛋白通过与白蛋白结合蛋白（albumin-binding proteins，ABPs）结合进入细胞，降解为氨基酸再被肿瘤细胞利用［1］。后续研究在各种组织细胞中陆续发现了7种ABPs，ABPs在肿瘤细胞中的功能和作用机制也逐渐成为研究热点。有研究发现，ABPs在癌细胞和肿瘤血管上皮细胞上呈高表达，负责白蛋白的摄取、转运、累积或再利用，与肿瘤形成、浸润和转移密切相关［2-3］。因此，ABPs有望作为肿瘤治疗或药物开发的新靶点。本文就ABPs在肿瘤细胞中功能及抗肿瘤药物中应用的研究进展作一综述。

1 ABPs在肿瘤细胞中的功能

1.1 Gp60（glycoprotein 60）受体介导肿瘤细胞对白蛋白的摄取Gp60受体也称为Albondin，是一种血管内皮膜蛋白。白蛋白与内皮细胞膜蛋白Gp60受体的结合激活了血管通透性调控蛋白Caveolin-1，从而诱导细胞膜小窝样囊泡的形成。小窝样囊泡在质膜上富含各种受体和信号分子，可促进细胞信号转导。如白蛋白与其Gp60受体的结合在小窝样囊泡中诱导Gp60聚集，引起Gp60受体和Caveolin-1的酪氨酸（Tyr）磷酸化，并伴随着细胞Src激酶（cSrc）活化和白蛋白跨内皮运输的增加［4-5］。在血管内皮细胞中，Tyr14-caveolin-1的磷酸化与小窝的萌芽和融合有关，提示其在大分子跨细胞转运中具有重要作用［6］。白蛋白与Gp60受体的结合实现了自身的内在化和转胞吞作用，避免了被自身的溶酶体降解。Gp60受体与膜蛋白Caveolin-1的结合是白蛋白转运的关键步骤［7］。表明Caveolin-1是基于白蛋白药物的潜在分子标记物。研究发现，Gp60受体在多种肿瘤细胞呈高表达，介导了肿瘤细胞对白蛋白的摄取，从而为肿瘤的快速增殖提供了氨基酸和能量。因此，越来越多的研究将Gp60受体作为肿瘤药物的靶点［4，8-9］。

1.2 与酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）结合对白蛋白及其药物在肿瘤细胞内累积的影响SPARC蛋白是一种由多种类型细胞分泌富含半胱氨酸的酸性蛋白，能够与细胞外基质中多种蛋白包括受体、生长因子和蛋白酶等结合［10］。有研究采用亲和层析法鉴定证明，分泌蛋白SPARC与血清白蛋白具有高亲和力，是通过结合和识别Gp60受体而发挥作用，推测SPARC可能介导了细胞对白蛋白的摄取［11］。研究发现，SPARC蛋白在多种肿瘤组织细胞和肿瘤微环境中呈高表达，并参与了肿瘤形成的多个生物学过程，如细胞周期、细胞黏连、迁移、血管形成和代谢等［12-13］。有研究提示，SPARC蛋白与白蛋白的结合增强了肿瘤间质内白蛋白结合药物的累积，作用机制为白蛋白可与细胞膜表面Gp60受体结合，激活细胞内蛋白-小窝蛋白-1，并诱发细胞膜内陷形成胞转小泡（caveolae），并将白蛋白通过内皮细胞转运进入细胞间隙。同时，白蛋白与肿瘤细胞上高表达SPARC蛋白相互作用，提高肿瘤组织摄取白蛋白［14］。初步临床数据表明，SPARC蛋白的表达水平与纳米颗粒白蛋白结合紫杉醇药物Abraxane®的敏感性相关，SPARC蛋白高表达的患者使用白蛋白结合紫杉醇药物后的临床效果较好［15］。但该项研究与敲除小鼠SPARC基因后药物效果的实验数据不一致，可能是由于小鼠敲除SPARC后并不影响肿瘤间质内Abraxane®的药物浓度。因此，SPARC蛋白与白蛋白的结合是否有助于白蛋白及其药物的摄取和累积尚有待进一步深入研究。

1.3 白蛋白与Gp18和Gp30受体结合对细胞自我保护的影响1988年，GHINEA等［1］在脂肪组织微血管和肺组织内皮细胞表面发现了与白蛋白结合的两个多肽，相对分子质量分别为30 000和18 000，命名为Gp30和Gp18。研究表明，与Gp60结合细胞内天然白蛋白不同，Gp18和Gp30受体并不优先与天然白蛋白结合，而是与构象修饰后的白蛋白相互作用［16］。细胞正常老化、保护性或病理性的反应会对白蛋白进行氧化、非酶糖化或马来酰胺化等修饰，而Gp18和Gp30受体可结合此类白蛋白并导致其降解。因此，与Gp18和Gp30受体的结合是细胞清除受损或有害白蛋白的有效途径［17-18］。但目前，对Gp18和Gp30受体的研究较少，在肿瘤细胞中的功能尚未明确，白蛋白修饰药物是否可与Gp18和Gp30受体结合从而发挥细胞自我保护作用也还有待进一步研究。

1.4 与新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）结合对白蛋白及相关药物半衰期的影响FcRn是MHC-Ⅰ类相关分子，由于可将抗体IgG从母体转运到胎儿或新生儿而命名［19］。FcRn具有调节免疫球蛋白IgG、白蛋白稳态和转胞吞作用，在自身免疫疾病、黏膜免疫及肿瘤免疫监视中发挥重要作用［19-21］。研究证实，FcRn主要以pH依赖的方式结合白蛋白，生理pH条件下两者不结合；酸性低pH（6.0～6.5）条件下两者结合，白蛋白经内体囊泡返回至细胞外空间，与FcRn分离而释放，避免了经溶酶体途径被降解，从而延长了半衰期［22-23］。人类内源性白蛋白的半衰期约为19 d，啮齿动物则为1.5～2.5 d［24］。基于该特性，将治疗性多肽或蛋白药物与白蛋白结合结构域（albumin-binding domain，ABD）融合，可有效提高药物在血液循环系统中的半衰期和稳定性。

FcRn在机体抗肿瘤机制中发挥着一定作用。与正常上皮细胞比较，FcRn在多种类型的肿瘤细胞系均呈低表达，因此在肿瘤细胞中过表达FcRn可抑制细胞增殖和移植瘤的形成。在肿瘤移植小鼠中敲低FcRn，小鼠出现低白细胞血症，而细胞内的白蛋白和谷氨酰胺水平增高［25］。FcRn与大肠癌细胞中CD8+T细胞的激活也有相关性，根据表达FcRn的树突状细胞的数目可预测大肠癌的预后情况。还有研究表明，肺癌组织中的FcRn表达水平与非小细胞肺癌的预后相关［26］。上述研究表明，FcRn可能不参与肿瘤细胞对白蛋白的摄取，另一方面也提示了FcRn可作为预后诊断指标和肿瘤治疗靶点。

1.5 钙网蛋白（calreticulin，CRT）对肿瘤细胞凋亡的影响FRITZSCHE等［27］研究显示，CRT可能是白蛋白结合蛋白。CRT位于内质网，相对分子质量约为46 000，是一种具有保守结构的Ca2+结合蛋白，其作用机制是通过干预MHC-Ⅰ分子及装配因子的加工折叠，影响抗原呈递细胞毒性T淋巴细胞，促进吞噬细胞对肿瘤细胞的摄取和吞噬，从而加速肿瘤细胞的凋亡［28］，还可调控细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）和血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表达，从而增强白细胞与内皮细胞的相互作用，促进淋巴细胞向肿瘤中的浸润［29］。在肿瘤疫苗方面，使用与靶抗原（如人乳头瘤病毒16 E7）连接的CRT DNA疫苗，可显著增强抗原特异性免疫反应［30］。因此，CRT在增强肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗的研发中具有重要意义。白蛋白作为靶向肿瘤的药物载体可能与CRT的结合有一定相关性。

1.6 真核细胞异质核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）作为早期肿瘤分子标记的潜力研究表明，除CRT外，hnRNPs也能够与白蛋白相结合［27］。hnRNPs家族是一组由RNA聚合酶Ⅱ产生的与前体转录物结合的核蛋白，目前已发现有20余种hnRNPs类蛋白质，其可与前体RNA结合形成RNP复合物。hnRNPs参与调控染色质重塑、mRNA转运、RNA剪接、RNA编辑和翻译后修饰等生物学功能，并在肿瘤发生中起重要作用［31］。研究发现，hnRNPs主要结合位于外显子或内含子中称为剪接沉默子的序列，诱导剪接沉默作用，该蛋白家族还可通过翻译后修饰作用，影响上皮间充质细胞转变，并参与肿瘤血管生成，改变细胞外基质和成纤维细胞等肿瘤微环境，进而影响肿瘤的转移和代谢［32］。hnRNPs在肿瘤组织中的高表达常作为早期肿瘤的分子标记物［31］，如hnRNP A2／B1作为肝癌的早期诊断分子［33］，hnRNP K作为结直肠癌和口鳞状细胞癌患者预后的分子标记［32，34］。与肿瘤免疫相关的hnRNPs见表1［32-33，35-39］。

表1 与肿瘤免疫相关的hnRNPs作用机制及作用结果Tab.1 Mechanism and result of action of hnRNP sassociated with tumor immunity

1.7 与Cubilin和Megalin受体的结合对白蛋白在近端小管中重吸收的影响由肾小球过滤的血清白蛋白可通过受体介导的内吞作用在近端小管中被重吸收，目前鉴定到两种参与该过程的细胞受体，即Cubilin和Megalin［40-41］。Megalin是一种大的跨膜蛋白（相对分子质量约600 000），属于低密度脂蛋白受体家族；Cubilin也称为内在因子钴胺素受体，是一种外周膜蛋白（相对分子质量约460 000）。研究发现，Megalin以高亲和力结合Cubilin，这可能有助于Cubilin-配体复合物的内化［42］。有研究采用亲和层析和表面等离子共振分析的方法，发现在肾近端小管上皮细胞中高表达的Cubilin可与白蛋白结合［43］。具有Cubilin功能缺陷的犬可在几乎完全消除近端小管再吸收的情况下，排泄大量白蛋白，表明Cubilin在近端小管摄取白蛋白中具有重要作用。另外，研究还发现，缺乏内吞受体Megalin的小鼠白蛋白的尿排泄改变，小管重吸收减少［44］。最新研究采用Cubilin和Meganlin单独敲除及两者同时敲除的小鼠进行实验，发现Cubilin的结合对近端小管细胞的重吸收至关重要，Megalin驱动Cubilin-白蛋白复合物的内化［45］。Cubilin在肾癌细胞高度特异表达，且肾癌患者预后不良与Cubilin的缺失相关，但尚无数据表明Cubilin在肾癌形成中的具体功能［46-47］。肾细胞癌对化学疗法和放射疗法不敏感，尚未鉴定到有效的早期诊断分子，Cubinlin是否可作为肾癌诊断分子还有待进行深入研究。

2 基于白蛋白的肿瘤靶向药物

肿瘤病灶靶点的药物浓度对其疗效至关重要。治疗性药物尤其是小分子药物进入人体后常出现非特异性分布，当相对分子质量低于肾脏过滤阈值时，由于肾脏快速清除而降低了药物在血液中的循环时间。为延长药物半衰期，可采用将聚乙二醇多肽或蛋白质分子融合，即将药物聚乙二醇化，如Adagen®和Pegasys®。由于聚乙二醇化必需的化学偶联和大分子聚乙二醇在肝脏中累积等缺点，开发不良反应少且半衰期长的药物愈发重要。基于对白蛋白及其结合蛋白的分析，白蛋白是理想的药物运输开发靶点，可有效改善药物尤其是抗癌药物的药代动力学。

2.1 与白蛋白直接偶联该策略适用于小分子药物。针对肿瘤微环境的变化，药效分子与白蛋白之间需通过对肿瘤微环境敏感的偶联分子进行连接，使药物特异且快速地在肿瘤部位进行释放，如阿霉素（doxorubicin）白蛋白药物Aldoxorubicin和甲氨蝶呤（MTX）-白蛋白药物［48-49］。

2.2 与白蛋白融合该策略适用于蛋白或多肽药物。将白蛋白通过基因工程的方法与药物分子进行融合，在酵母或哺乳动物细胞内进行表达，如重组白蛋白与人表皮受体HER的融合有效抑制了肿瘤细胞的增殖［9，50］。采用该方法进行药物开发时需关注靶基因对白蛋白正确折叠的影响。

2.3 白蛋白纳米颗粒药物该方法是将单克隆抗体功能化片段与白蛋白结合，延长药物半衰期，同时增强抗原的免疫应答。单克隆抗体能够特异性靶向肿瘤部位，但由于传统抗体结构较大，肿瘤渗透能力差，影响单抗的功能发挥。单抗的功能化片段即纳米抗体与白蛋白融合的方法可较好地解决上述问题。由于该药物具有高亲和力、良好的耐受性，且无严重的不良反应，受到广泛关注。如白蛋白紫杉醇药物及发肿瘤靶向的白蛋白纳米颗粒药物均取得了较好的临床效果［51-52］。