柯萨奇病毒A组6型中和抗体检测用毒株病毒滴度标定及其专属性和适用性评价

陈磊，孟庆敏，张改梅，孙光卫，耿丽娜，金加洪，赵丽丽，谢学超，徐颖之，顾美荣，卞莲莲，刘建凯

1.北京民海生物科技有限公司研发中心 北京市新型联合疫苗工程技术研究中心，北京 102600；2.江苏省连云港市赣榆区疾病预防控制中心，江苏 连云港 210000；3.江苏省新沂市疾病预防控制中心，江苏 新沂 221400；4.江苏省盐城市射阳县疾病预防控制中心，江苏 盐城 224300；5.中国食品药品检定研究院肝炎病毒疫苗室，北京 102600

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种丙类传染性疾病，常见于5岁以下婴幼儿，主要临床表现为发热及手、足、口腔等部位出现斑丘疹、疱疹［1］，部分病例可并发脑膜炎、心肌炎和神经系统症状等重症，甚至死亡［2］。HFMD的主要病原体为肠道病毒71型（enterovirus，EV71）、柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CA16）和柯萨奇病毒A组6型（coxsackievirus A6，CA6）等［3］，属于小RNA病毒科肠道病毒属。近年，CA6在全球范围内流行，在我国大陆及其他国家部分地区，CA6甚至取代EV71和CA16成为HFMD病原谱中占比最高的病原体［4-12］。CA6感染儿童引起的HFMD表现出一系列非典型症状或后遗症，如非典型部位的皮疹疱疹、皮肤损伤、脱甲症等［13］，且可导致成年人罹患HFMD，甚至可能导致长期后遗症［14-16］，给公共卫生安全带来较大负担，加强对其防控具有重要意义。

目前，HFMD尚无有效预防措施和治疗方法，接种疫苗是控制HFMD流行的重要手段。中和抗体效价是评价疫苗免疫原性的关键指标之一［17-20］，其检测结果的准确性对疫苗研发和应用均具有重要意义。本研究对北京民海生物科技有限公司（简称北京民海）研发中心从人横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）自行分离获得的CA6毒株作为中和抗体候选检测毒株进行病毒滴度标定，并评价该毒株的专属性和适用性，以期用于后续疫苗的质量控制。

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞CA6候选检测毒株由北京民海研发中心采自中国大陆HFMD流行区患儿的咽肛拭子，样本经RD细胞分离、蚀斑纯化、适应性传代培养后，分装（0.5 mL／支，500支），建立工作种子批，－60℃以下保存；RD细胞由该中心保存。

1.2 主要试剂MEM培养基购自日本日水制药株式会社；胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。

1.3 血清CA6、EV71、CA16、CA10病毒收获液免疫NIH小鼠获得的血清（分别标记为A6-S1、71-S1、A16-S1、A10-S1）及其阴性对照血清（病毒维持液免疫NIH小鼠获得的血清，标记为Z）由北京民海研发中心研发一室提供；人血清为江苏和广东地区的EV71和CA16等血清流行病学调查及EV71疫苗Ⅲ期临床试验前HFMD病例监测的自然感染人血清。

1.4 CA6候选检测毒株的检测 根据《中国药典》三部（2020版）“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的要求，对工作种子批进行鉴别试验、无菌检查、支原体检查、分子生物学鉴定等［21］。

1.5 CA6候选检测毒株病毒滴度的测定 将1.5×105个／mL的RD细胞接种至96孔板中，0.1 mL／孔；接种CA6候选检测毒株病毒液（10－3～10－10稀释），100 μL／孔，每个稀释度设8个复孔，同时设8孔细胞对照（仅补加病毒维持液），于（35±0.5）℃，5%CO2培养箱中放置7 d，观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）情况。以能使50%细胞孔发生CPE的最高稀释度为终点，1个视野下出现CPE即判为阳性（+），否则判为阴性（－），并按下式计算病毒滴度［22］。由3名实验员（A、B、C）于3 d分别进行3次独立测定，根据27次检测结果标定该毒株的病毒滴度。

式中L为病毒最低稀释度的对数值，d为稀释度系数对数值，S为CPE阳性孔比率总和。

1.6 中和抗体检测 参照文献［23-24］方法，建立CA6中和抗体检测方法。待测样品（1∶8稀释）经56℃灭活30 min；加至96孔板中，0.05 mL／孔，进行2倍系列稀释（1∶8～1∶16 384），加入100 CCID50／50 μL的CA6病毒悬液，50 μL／孔，于37℃中和2 h；加入1.5×105个 ／mL的RD细胞悬液，0.1 mL／孔，置（35±0.5）℃，5%CO2培养箱中培养7 d。每次试验均设病毒回滴试验，结果在32～320 CCID50／孔判为试验成立。以能抑制50%细胞病变最高稀释度的倒数作为CA6抗体中和效价，≥1∶8判为CA6中和抗体阳性，＜1∶8判为阴性。

1.7 CA6候选检测毒株的专属性评价 将血清A6-S1、71-S1、A16-S1、A10-S1和Z用CA6候选检测毒株分别进行中和抗体效价测定，方法同1.6项，每份血清重复测定2次。

1.8 CA6候选检测毒株的适用性评价 分别取12份CA6小鼠免疫血清（编号为M1～M12）和12份CA6自然感染人血清（P1～P12），用CA6候选检测毒株进行中和抗体测定，方法同1.6项，每份血清重复测定6次，并计算中和抗体效价的几何平均值（geometric mean titer，GMT）。CA6抗体中和效价为阴性时，按1∶4计算，CA6抗体中和效价＞1∶16 384时，按1∶24 576计算。

1.9 统计学分析 应用SPSS 20.0和EXCEL 2020进行统计学分析，不同实验员对CA6候选检测毒株病毒滴度检测结果的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CA6候选检测毒株工作种子批检测结果CA6候选检测毒株工作种子批无菌检查、支原体检查均符合要求；分子生物学鉴定属D3亚型；CA6候选检测毒株感染RD细胞3 d后发生明显CPE，见图1。

图1 CA6候选检测毒株致RD细胞CPE的镜下观察（×100）Fig.1 Microscopy of CPE of RD cells infected with candidate CA6 strain（×100）

2.2 CA6候选检测毒株的病毒滴度A、B、C实验员测定病毒滴度均值分别为（7.861±0.075）、（7.819±0.110）、（7.875±0.140）LgCCID50／mL，95% CI分别为（7.803～7.919）、（7.735～7.904）、（7.768～7.875）LgCCID50／mL，CV分别为0.96%、1.41%、1.77%，3名实验员的检测结果差异无统计学意义（F=0.605，P＞0.05），见表1。最终标定该毒株病毒滴度为7.852 LgCCID50／mL（95% CI：7.808～7.895 LgCCID50／mL）。

表1 病毒滴度检测结果（LgCCID50／mL）Tab.1 Determination result of virus titer（LgCCID50／mL）

2.3 CA6候选检测毒株的专属性 重复2次测定A6-S1的中和抗体效价分别为1∶3 072和1∶4 096，为阳性；71-S1、A16-S1、A10-S1和Z的中和抗体效价均＜1∶8，为阴性。表明CA6候选检测毒株具有良好的专属性。

2.4 CA6候选检测毒株的适用性12份小鼠血清中和抗体GMT为1∶82～1∶22 970，12份自然感染人血清中和抗体GMT为1∶41～1∶22 970。每份血清重复检测中和抗体效价的最大值与最小值（MAX／MIN）比值均 ＜4，CV在1.65%～12.44%之间。见表2，表明CA6候选检测毒株具有良好的适用性。

表2 CA6候选检测毒株适用性评价结果Tab.2 Evaluation of applicability of candidate CA6 strain

3 讨论

HFMD是一种常见传染病，目前已成为亚太地区尤其是中国严重的公共卫生问题。全球范围内，该病的流行病原在不断变化，自2008年以来，CA6型HFMD在芬兰暴发［25］，随后该型HFMD在多个国家及地区迅速流行［26-29］。近年，根据获得的HFMD流行病学和病原学调查数据，认为CA6与EV71和CA16一样，可通过接种疫苗进行预防［30］。目前，EV71疫苗已上市，CA16单价疫苗及重组EV71／CA16双价疫苗处于临床前试验阶段［31-32］，其对CA6均无交叉保护，因此急需进行CA6疫苗或多价疫苗的研制。

在CA6单价疫苗或多价疫苗的研制过程中，CA6中和抗体效价检测是疫苗研制中的重要检测指标，检测方法的建立至关重要。CA6候选检测毒株由北京民海研发中心采用RD细胞自行分离，建立了工作种子批，本研究对工作种子批进行相关检测，结果显示，工作种子批无菌检查、支原体检查均符合要求，分子生物学鉴定属D3亚型。该毒株与同为肠道病毒属的EV71、CA16、CA10免疫血清均无交叉，仅被CA6免疫血清中和，具有良好的专属性。由3名实验员对工作种子批进行滴度标定，平均滴度为7.852 LgCCID50／mL，CV为1.40%。用该毒株对12份CA6小鼠免疫血清和12份自然感染人血清进行6次中和抗体效价检测，中和抗体效价的MAX／MIN均 ＜4，CV均 ＜13%，表明该毒株具有良好的适用性，可用于临床前免疫原性研究中小鼠血清中和抗体效价测定，也有望应用于临床研究中人血清中和抗体效价测定。

综上所述，该CA6候选检测毒株可作为CA6中和抗体效价测定方法的检测毒株，但本研究未进行CA6中和抗体效价检测方法的验证，今后将进行深入研究。本研究为CA6单价疫苗或多价疫苗的质量控制研究提供了实验依据。