SARS-CoV-2非结构蛋白兔抗血清的制备及其在灭活疫苗质量监控中的应用

汪梦俊，安欢欢，田宇璇，刘睿伦，张小宇，吴杰，郭靖，申硕

武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室，湖北 武汉 430207

截至目前为止，SARS-CoV-2全球累计感染病例已近6亿人次，并出现多种如α、β、γ等值得关注的突变株（variants of concern，VOC），对人类生命健康安全及公共卫生事业造成极大威胁［1］。现有研究表明，非结构蛋白（non-structure protein，NSP）在病毒的变异及传播过程中发挥重要作用［2］。NSP是病毒复制过程中发挥关键作用，但不作为病毒颗粒组分存在的蛋白，通常具有RNA复制、修饰、校对等活性［3-5］。SARS-CoV-2共包含16个NSP［6］，其中，非结构蛋白1（NSP1）是SARS-CoV-2编码的第1个NSP［7］，在病毒感染细胞后，能够与宿主细胞核糖体40S小亚基结合，介导宿主mRNA 5′-非翻译区（untranslated region，UTR）附近的区域被核酸内切酶酶切［8］，而由于病毒mRNA存在1个5′-端前导序列，使得病毒自身mRNA避免被切割［9］。在对SARS-CoV-2的研究中，NSP1与核糖体40S小亚基之间的相互作用已被证明与其第164位赖氨酸残基（K164）高度相关［10］。而反向遗传学试验也证明，SARS-CoV-2 NSP1 C-端结构域与α-干扰素的mRNA降解有关［11］。

然而，目前对NSP1结构及功能的认识相对不足，如NSP1如何与其本身mRNA保守的5′-UTR相互作用，从而避免自身mRNA降解的机制仍不清楚［12］。而研究NSP1在SARS-CoV-2复制过程中的具体作用机制可为SARS-CoV-2抗病毒药物研发、减毒位点发掘及感染后治疗提供更为可靠的方向和途径［13］。同时，检测SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中NSP1含量的变化，还可为灭活疫苗生产提供1个质量监控指标。因此，本研究制备了NSP1兔抗血清，旨在为SARS-CoV-2 NSP1功能的进一步研究及灭活疫苗质量监控方法的确立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、载体及样品E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）感受态细胞购自日本TaKaRa公司；Vero细胞、带有GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1及带有eGFP标签的pcDNA3.1为武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室保存，RD细胞由该公司质量控制部门提供，SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中的细胞裂解液及纯化病毒颗粒样品由该公司新发传染病疫苗室提供，SARS-CoV-2 S、N、M、E蛋白兔抗血清为该公司病毒性疫苗研究一室制备［14］。

1.2 主要试剂及仪器DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及DNA清洁试剂盒购自德国QIAGEN公司；DNA聚合酶Phanta®及无缝连接试剂盒Clon ExpressⅡ购自南京诺唯赞生物科技有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ购自美国NEB公司；T4 DNA连接酶、BCA试剂盒、PageRuler Plus预染蛋白marker（26619）、转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Thermo公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；鼠抗eGPF单抗购自美国Abcam公司；HRP标记的兔抗鼠IgG、HRP标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司；ImmobilonTM Western购自美国Millipore公司；SDS细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；加强型膜再生液购自北京普利莱基因技术有限公司；eBlotTML1快速湿转仪购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 实验动物 普通级日本大耳白兔，雄性，3月龄，体重2.0～2.5 kg，由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物中心提供，动物合格证号：4200-0400011459。本实验均以科研为目的进行大耳白兔的养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行（WIBPAII382021002）。

1.4 引物设计及合成 根据SARS-CoV-2武汉株全基因序列（NC_045512），通过ProteinHomology／analog Y Recognition Engine V 2.0对NSP1亲水性进行分析后，选取NSP1全段作为抗原序列。同时，经引物设计在目的基因两端插入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点及相应的保护碱基，引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 载体构建相关引物Tab.1 Primers for vector construction

1.5 抗原制备及纯化 以SARS-CoV-2 WIV04株基因组（MN996528.1，由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室提供）为模板，PCR扩增获得相应目的片段，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，用相同酶酶切带有GST标签的pGEX-6p-1质粒，将目的基因片段与线性化载体片段经T4 DNA连接酶连接，电转至E.coli DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养；挑取单菌落，利用引物pGEX-6p-1-Check-F、pGEX-6p-1-Check-R进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的菌落提取质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序正确的质粒命名为pGEX-6p-1-GST-NSP1。

将质粒pGEX-6p-1-GST-NSP1电转至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落，经PCR鉴定后，于LA（LB+Amp）液体培养基进行扩大培养，加入IPTG至终浓度为1 mmol／L，设不加诱导剂的对照组，37℃培养7 h；取5 mL菌液，进行8% SDSPAGE分析。

取200 mL菌液，15 000×g离心3 min；收集沉淀，用0.01 mol／L PBS（pH 7.2）重悬，冰水浴下100 W超声破碎20 min；PBS重悬，重复破碎2次。分别收集第1次破碎上清及3次破碎后沉淀，进行8% SDS-PAGE分析。

取破碎后菌体沉淀，用8 mL PBS溶解，并加入2 mL 5×protein loading，100℃煮样10 min变性；经8%琼脂糖凝胶电泳分离及电洗脱后，即获得纯化的目的蛋白。将纯化后的目的蛋白置透析袋中，用0.01 mol／L PBS透析去离子，BCA蛋白浓度测定试剂盒进行检测。将纯化后蛋白稀释至400 ng／mL，按500 μL／管分装至1.5 mL EP管中，置-50℃冰箱冻存。

1.6 兔抗血清的制备 取2只日本大耳白兔，1只作为实验组，以冻存的500 μL／管分装的GSTNSP1为抗原；另1只作为对照组，以等体积的PBS作为抗原。将抗原与等体积（500 μL）弗氏完全佐剂充分振荡乳化后，经背部多点注射的方式进行初次免疫，200 ng／剂，之后每间隔14 d，与弗氏不完全佐剂等剂量乳化进行加强免疫，共免疫6次。收集全血血清，置37℃孵箱孵育2 h；6 500×g离心5 min；收集上清再次离心，重复2次，所得上清即为纯化后的兔抗血清。按兔抗血清∶100%甘油∶PBS（10×）=10∶9∶1的比例混匀，分装后置-50℃保存备用。

1.7 兔抗血清的鉴定

1.7.1 纯度 采用Western blot法。将纯化后重组GST-NSP1蛋白经8% SDS-PAGE分离后，eBlotTML1快速湿转仪电转至硝酸纤维膜上，5% BSA 4℃封闭过夜；加入各组血清（均1∶10 000稀释），4℃孵育12 h；PBST洗涤，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶10 000稀释），室温孵育45 min；PBST洗涤，化学发光仪扫描，保存图片。

1.7.2 特异性 为进一步证明抗NSP1抗血清的特异性，采用人RD细胞瞬时表达、剪切和加工成熟的NSP1蛋白对抗血清进行特异性验证。以上述构建的带有NSP的重组质粒pcDNA3.1-NSP及质粒pcDNA3.1为模板，利用pcDNA3.1-NSP1-eGFP载体构建相应引物对扩增带有互补同源臂的NSP1（eGFP）及eGFP（NSP1）序列。同时通过EcoRⅠ、XhoⅠ37℃3 h酶切pcDNA3.1空载体，获得长度5 366 bp的线性化载体片段。将对应的带有同源臂的NSP1和eGFP片段与线性化载体片段按摩尔比3∶3∶1混合后，经Infusion-HD Enzyme 50℃反应15 min，连接产物电转至E.coli DH5α感受态细胞，利用在pcDNA3.1插入位点两侧设计的鉴定引物，对重组质粒pcDNA3.1-NSP1-eGFP进行PCR鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。挑取鉴定及测序正确的保存菌种进行扩大培养。

用LipofectamineTM2000转染试剂，将提取的2.5 μg pcDNA3.1-NSP1-eGFP、pcDNA3.1-eGFP（阳性对照）及pcDNA3.1（阴性对照）质粒分别于6孔板中转染RD细胞（细胞密度60%～70%），转染5 h后更换维持液，继续培养48 h后，观察到明显荧光，即NSP1-eGFP融合蛋白正确表达。用SDS-裂解液裂解转染细胞，离心收集裂解上清，变性后按1.7.1项方法进行Western blot分析，显色后用加强型膜再生液室温洗涤5 min，用鼠抗eGFP单抗（1∶5 000稀释）作为一抗，HRP标记的兔抗鼠IgG（1∶10 000稀释）作为二抗，重新进行Western blot分析。

1.8 灭活疫苗细胞裂解液及纯化病毒颗粒的鉴定取SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程1～4 d的细胞裂解液及纯化后的病毒颗粒样品，变性后按1.7.1项方法，以SARS-CoV-2 S、N、M、E蛋白的兔抗血清作为一抗（1∶2 000稀释），HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗（1∶10 000稀释），进行Western blot分析，以未感染SARS-CoV-2的Vero细胞为对照。

2 结果

2.1 重组质粒pGEX-6p-1-GST-NSP1的鉴定GSTNSP1基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 221 bp的特异性条带，大小与预期相符，见图1，测序后与模板序列一致。表明质粒构建正确。

图1 GST-NSP1基因PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of GST-NSP1 gene

2.2 重组蛋白的鉴定 表达的重组GST-NSP1蛋白经8% SDS-PAGE分析，相对分子质量约45 300，对照组未见此条带，表明质粒pGEX-6p-1-GST-NSP1在E.coli BL21（DE3）中成功表达；超声破碎后上清及沉淀经8% SDS-PAGE分析，沉淀中目的蛋白含量明显高于上清，主要以包涵体形式存在。见图2。

图2 表达（A）及纯化的重组GST-NSP1蛋白（B）的SDSPAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile of expressed（A）and purifed（B）recombinant GST-NSP1

2.3 兔抗血清的鉴定

2.3.1 纯度Western blot分析显示，在相对分子质量约45 300处可见特异性反应条带，且无杂带，见图3。表明兔抗血清纯度良好。

图3 兔抗血清纯度的Western blot分析Fig.3 Western blotting of purity of rabbit antiserum

2.3.2 特异性

2.3.2.1 pcDNA3.1-NSP1-eGFP质粒的鉴定NSP1-eGFP基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 840 bp的目的条带，见图4，表明目的基因已正确插入至目标位点。测序结果与质粒图谱一致，证明质粒构建正确。

图4 NSP1-eGFP基因PCR扩增产物电泳图Fig.4 Electrophoretic profile of PCR product of NSP1-eGFP gene

2.3.2.2 NSP1-eGFP融合蛋白的鉴定 荧光显微镜下观察可见，质粒pcDNA3.1-NSP1-eGFP转染RD细胞24 h后，肉眼可见荧光，阳性对照组也可见明显荧光，而阴性对照组未见荧光，见图5。表明融合蛋白NSP1-eGFP成功表达。

图5 NSP1-eGFP融合蛋白在RD细胞中表达的荧光显微镜观察（×40）Fig.5 Fluorescence microscopy of expression of NSP1-eGFP fusion protein in RD cells（×40）

2.3.2.3 兔抗血清的特异性Western blot分析显示，NSP1兔抗血清与鼠抗eGFP单抗均可识别相应的NSP-eGFP融合蛋白，见图6。表明制备的NSP1兔抗血清可正确识别带有真核细胞内修饰的NSP1蛋白。

图6 兔抗血清特异性的Western blot分析Fig.6 Western blotting of specificity of rabbit antiserum

2.4 灭活疫苗细胞裂解液及纯化病毒颗粒的鉴定与未感染SARS-CoV-2的Vero细胞对照组相比，SARS-CoV-2感染的Vero细胞2～4 d裂解液出现明显的4种结构蛋白和NSP1。第1天仅N、E蛋白出现较浅条带，呈现早期高表达特性，且E蛋白除出现相对分子质量预测大小的8 400的条带外，在相分子质量15 000附近出现1条同样趋势的条带，与SARS-CoV E蛋白N-Link糖蛋白大小相符；第2天开始产生大量的NSP1蛋白及4种主要结构蛋白；至第4天，伴随感染细胞裂解，活细胞数减少，结构蛋白S、M、N和NSP1浓度达到病毒收获期峰值，而E蛋白浓度在检测水平线下。见图7。

图7 细胞裂解液及纯化后病毒颗粒的Western blot分析Fig.7 Western blotting of cell lysates and purified virus particles

3 讨论

SARS-CoV-2的广泛传播给人类生命健康造成巨大威胁［15-16］。而应对疫情最有效的措施是广泛的疫苗接种［17］，建立群体免疫屏障，阻断病毒在人群中的传播。据WHO统计，截至目前为止，进入临床的SARS-CoV-2疫苗共13种，其中灭活疫苗21种，占15%，进一步证明了灭活疫苗在SARS-CoV-2防治过程中的重要作用［18-19］。灭活疫苗效力的关键在于毒种分离培养、高滴度毒种选择以及病毒颗粒的灭活和纯化工艺的质量控制。高效价、特异性的抗SARS-CoV-2抗体的制备和应用，对SARS-CoV-2结构、功能和致病机理研究，以及灭活疫苗的质量监控具有重要的意义。

本研究选取具有遗传背景清晰、操作简单、生长周期短、成本低廉、便于大规模发酵培养等优点的E.coli BL21（DE3）蛋白表达系统［20］，以带有GST标签的pGEX-6p-1作为表达载体，成功诱导表达了带有GST标签的SARS-CoV-2 NSP1蛋白，纯化后经6次免疫日本大耳白兔，获得NSP1兔抗血清，Western blot分析显示，制备的兔抗血清具有良好的特异性。随后构建了NSP1-eGFP融合蛋白，对制备的兔抗血清进行了检测，结果显示，兔抗血清能够较好地识别带有真核修饰的相应NSP。证明制备的兔抗血清能够用于SARS-CoV-2 NSP1功能的研究。与此同时，对SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中细胞裂解液以及纯化后的病毒颗粒样品的Western blot分析显示，NSP1抗原与3个主要结构蛋白在病毒感染细胞第2天后同时稳定表达，制备的兔抗血清能够应用于病毒颗粒纯化前后样品相应蛋白的检测。灭活疫苗仅含结构蛋白，不含NSP。E蛋白与M蛋白是SARSCoV-2和SARS-CoV-2病毒颗粒装配的主要蛋白，二者的瞬时细胞转染即可形成病毒样颗粒。病毒颗粒中M蛋白的分子数最高，而E蛋白的分子数最少。本研究发现，SARS-CoV-2 E蛋白可能与SARS-CoV E蛋白均为N-linked的糖蛋白。E蛋白在病毒感染的Vero细胞中早期表达的生物学意义、在病毒颗粒装配中的机理以及是否存在糖基化形式均值得进一步研究。而纯化后的灭活疫苗样品中主要包含S、M、N蛋白，未检测到NSP1、E蛋白。NSP1不装配于病毒颗粒，验证了纯化灭活疫苗的纯度。加样量对照中，SARS-CoV-2的细胞裂解液及Vero细胞对照中均出现管家蛋白β-actin条带，而纯化样品中则仅出现极微弱条带，鉴于Western blot分析的敏感型，也间接证明纯化灭活疫苗具有较高纯度。

综上所述，宿主细胞富含NSP1，可作为标志残留蛋白检测纯化灭活病毒纯度。本研究制备的NSP1兔抗血清，为后续灭活疫苗纯度及质量评估方法的建立奠定了基础，也为NSP1的功能及抗病毒药物靶点的研究提供了工具抗体。