基于ITS序列对几株野生大型真菌的鉴定

朱 链，侯怡铃，白 鑫，丁 祥

(西华师范大学 a.生命科学学院，b.西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，c.环境科学与工程学院，四川 南充 637009)

通过观察真菌的生长环境，比较真菌形态或微观特征，再结合生理、生化和营养实验的传统真菌鉴定方法需要有丰富的真菌鉴定工作经验，而且还需要大量的时间。许多真菌的生长条件特殊，形态相似性较高，仅通过传统的表型特征来识别，难免会产生假阳性或假阴性结果，因此很难准确鉴定[1-2]。随着分子生物学的迅速发展，真菌基因组的组成也逐渐被发现。真菌基因组中有4个编码核糖体rRNA的基因，包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA[3-4]。18S至28S之间的rDNA片段含有片段化的真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)，该区域的核苷酸序列随时间变化非常缓慢，可用于相对较远生物体的进化比较。因此对rDNA的序列分析可用于鉴定未知分子量或验证表型鉴定结果[5-7]。但是，对未知真菌的识别如果仅基于编码rDNA的序列分析，会因为大量相似序列而增加菌种鉴定的难度，不同物种之间相似序列的差异非常小，有的可达到99%的相似性[8-11]，传统的分类方法可以在这时更好地辅助确定菌种类型。

四川宜宾老君山位于四川南部，有较原始的森林植被，雨量充沛，光照适宜，土壤有机质丰富，适宜真菌生长。真菌采集地海拔1 193 m，北纬27°50′，东经103°36′。本研究对采自四川宜宾老君山地区的6株菌株进行分类鉴定，判断是否有真菌新种，并为后续真菌种类鉴定提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

真菌样品于2019年8月采集于四川宜宾老君山地区(标记为1、3、4、5、8、26号)，采集过程中记录其生活环境、生物习性，拍照记录，然后将其晾干带回西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，储存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要试剂和仪器

2x Taq PCR MasterMix(天一辉远)，DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)，DNA纯化回收试剂盒(天根生物科技有限公司)，PCR引物(成都生工生物技术公司)，乙醇等化学试剂(成都金山化学试剂有限公司)，ddH2O(实验室自制)。

台式离心机Mikro 120(MIKRO)，PCR仪 Thermal Cycler 2720(Applied Biosystem)，电泳仪DYY-6C(北京六一)，紫外分析仪Gel DocTMXR+(BIO-RAD)，ABI 3730 XL(Applied Biosystem)。

1.3 实验方法

1.3.1 传统分类法鉴定

根据6种真菌形态学特征并参照《中国大型真菌彩色图谱》[12]《中国大型菌物资源图鉴》[13]《中国真菌志》[14-16]鉴定种属。

1.3.2 真菌总DNA提取

取10 mg菌体剪碎，迅速加入液氮研磨成粉状，转移至2 mL离心管。65 ℃水浴30～40 min。参照DNA提取试剂盒说明提取总DNA，将其加入3%琼脂糖凝胶中电泳以检测是否提取到真菌DNA。根据DNA纯化回收试剂盒说明回收提取的DNA。提取到的总DNA放入-20 ℃冰箱保存以待扩增。真菌基因组ITS序列PCR扩增参考文献[17]。

1.3.3 PCR结果检测

取扩增反应产物5.0 μL并与6×Loading Buffer混匀，在含有10 mg·mL-1Gold View的3%琼脂糖凝胶上点样，将含有样品的琼脂糖放在1.0×TAE缓冲液中电泳，电压为120 V。当出现的条带离点样孔大约距离整个胶的2/3处时停止电泳，取出凝胶放在凝胶成像系统中，观察并拍照。

1.3.4 PCR产物纯化以及测序

将500～700 bp左右的目的条带小心用无菌手术刀割下，参照凝胶回收试剂盒说明进行回收纯化，将纯化后的PCR产物送成都生工生物技术公司进行上下游引物双向测序。

1.4 进化树的构建

将测序结果上传至GenBank获得登录号，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载登记序列中含有与该6种序列相似度高的片段，利用DNAMAN 8软件对序列进行分析，然后截去两侧扩增差异较大的碱基对，使比对的序列大小几乎一致，再用Clustalx软件进行完全比对，利用MEGA 7.0软件采用邻位相连法(N-J，neighbor-joining)构建系统进化树[18-21]。

2 结果与分析

2.1 传统分类法的最初鉴定结果

6株野生真菌的生境如图1所示，依据其生境和菌盖、菌褶、菌柄等特征，初步鉴定结果为：1号为棒束孢属(Cordyceps)，3号湿伞菌属(Hygrocybe)，4号珊瑚菌属(Clavaria)，5号银耳属(Pseudohydnum)，8号小菇菌属(Mycena)，26号拟锁瑚菌属(Clavulinopsis)。

2.2 PCR扩增结果

提取6株真菌菌株总DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳后均能在500～750 bp出现目的条带(图2)，表明扩增出的片段可以进行后续建树。

2.3 DNA-ITS序列测序与比对结果

6株真菌的登录号如下：1号真菌样品登录号为OL617416，3号真菌样品登录号为OL617418，4号真菌样品登录号为OL617419，5号真菌样品登录号为OL617420，8号真菌样品登录号为OL616140，26号真菌样品登录号为OL616134。N-J系统发育树如图3所示。在序列比对时，两个不同序列相似性达到90%可以鉴定为同种[22-25]，1号真菌样品与大草蝉草菌(Cordycepscicadae)有高达98%的相似度，3号真菌样品与鸡油菌状湿伞(Hygrocybecantharellus)有高达99%的相似度，4号真菌样品与碎白珊瑚菌(Clavariafragilis)有高达99%的相似度，5号真菌样品与胶质刺银耳菌(Pseudohydnumgelatinosum)有高达99%的相似度，8号真菌样品与盔盖小菇菌(Mycenagalericulate)有高达99%的相似度，26号真菌样品与环沟拟锁瑚菌(Clavulinopsissulcate)有高达99%的相似度。

3 讨 论

结合运用传统分类和ITS序列分析法对四川宜宾老君山地区采集的6株菌株进行了鉴定。受真菌生境影响，许多真菌的形态特征具有较高的相似性，且传统分类法对鉴定者的经验丰富度要求较高，因此仅依靠该方法对真菌鉴定可能存在较大难度[26]，故根据传统分类法花费了很多时间查阅资料才将6株菌株鉴定出来，将6株菌株进行初步分类时仅鉴定到属。应用分子生物学方法鉴定物种的关键是要获得纯度较高、量多且稳定的DNA模板，因而碾磨菌体就尤为关键[27]，碾磨时要迅速充分，否则提取到的DNA就不够或不纯。序列比较和分析中，由于基因库不断完善，不同物种的ITS序列出现了较多的相似序列，在选择序列进行建树时要综合考虑这些序列和目的序列的相关性，选择出与目的序列相同科属的真菌序列。可选择几个具有较高相关性的同种真菌的不同序列建树，以提高可信度。结合rDNA-ITS序列分析法对6株菌株进一步在种层次进行鉴定，结果显示rDNA-ITS序列分析法鉴定出的菌种所归的属与传统分类法鉴定出的属相互契合。总体来说，形态学分类仍然在真菌分类学上起到举足轻重的作用。在真菌鉴定过程中依据真菌形态、生理特征、生态特征鉴定出属，再结合分子序列鉴定到种，二者结合综合分析可使分类鉴定更准确客观。