稻纵卷叶螟颗粒体病毒亚致死作用对宿主生长、繁殖和生理生化的影响

刘 琴，李传明，韩光杰，徐 彬，黄立鑫，陆玉荣，夏 杨，徐 健*

（1. 江苏里下河地区农业科学研究所/国家农业微生物扬州观测实验站，扬州 225007；2. 扬州绿源生物化工有限公司，扬州 225008）

稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是为害水稻的重要迁飞性害虫。由于耕作制度调整、品种更替及气候环境改变等影响，稻纵卷叶螟的发生数量和为害程度逐年加重，给水稻生产造成严重的损失[1]。长期以来稻纵卷叶螟的防控主要依赖化学农药[2]，但大量的化学农药使用并未有效控制害虫为害，同时由于杀虫剂的有效剂量随时间及环境的影响而逐渐降低[3]，导致接触低于死亡剂量化学农药的个体产生亚致死作用[4]。稻纵卷叶螟颗粒体病毒（Cnaphalocrocis medinalis gralulovirus，CnmeGV）是感染稻纵卷叶螟的专性杆状病毒（baculovirus），对稻纵卷叶螟幼虫具有较强感染毒力[5]，田间应用CnmeGV可以显著抑制害虫种群增长，子代稻纵卷叶螟种群增长趋势指数（I）从20.03下降至6.30，作为防治稻纵卷叶螟的生物因子，具有重要应用价值[6]。目前有关杆状病毒亚致死作用的研究较少，其作用机制也不清楚。针对化学农药开展的亚致死作用的研究表明，杀虫剂的亚致死效应作为一种普遍现象广泛存在于农业生态系统中[7]。亚致死作用可能通过诱导害虫生理生化变化而导致害虫对农药产生抗药性[8]，以及具有刺激害虫生殖、引发害虫再猖獗为害的效应[9]。不同于化学杀虫剂，杆状病毒的感染是病毒与宿主交互作用的动态过程，昆虫利用其保护机制降低病毒对自身的影响[10,11]，病毒则通过干扰和克服宿主免疫响应促进感染[12]。杆状病毒感染宿主并不总是导致昆虫产生系统感染，部分虫体接触低剂量的杆状病毒后，害虫体内带毒但并不表现出感病症状且继续存活并完成生活史[13,14]。CnmeGV低剂量处理稻纵卷叶螟幼虫感染死亡率显著降低，但正常存活的幼虫虫体组织内普遍检测到病毒的存在，病毒在害虫种群中能形成持续感染[15]。这种在低于死亡剂量下的持续感染可能对存活害虫生长发育、生理代谢及子代种群结构产生潜在影响。本研究基于CnmeGV对稻纵卷叶螟的持续感染作用，通过亚致死剂量处理害虫，分析 CnmeGV对稻纵卷叶螟形成的亚致死效应，研明杆状病毒CnmeGV亚致死作用对害虫生长发育、繁殖力的影响，分析其作用机制，为应用CnmeGV防治稻纵卷叶螟为害提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 稻纵卷叶螟的饲养

稻纵卷叶螟成虫采自江苏省扬州市郊稻田，按♀:♂＝1:1配对放入V＝125 mL的塑料水杯中交配产卵。室内繁殖参考Xu等[16]方法制备人工饲料，在（25.0±0.5）℃、相对湿度80%、光照度2000 lx的生化培养箱内饲养。饲养繁殖多代后，挑选健康、虫体大小一致的2龄或3龄幼虫供试。

1.2 CnmeGV增殖和亚致死感染

CnmeGV原始包涵体（occlusion body，OB）病毒为实验室保存。选择2龄中期稻纵卷叶螟幼虫预饥6 h，接种于均匀混合1×105OB/g病毒的人工饲料上饲养2 d，更换新鲜人工饲料饲养至5龄，收集感病症状明显的虫尸[5]，研磨、匀浆、过滤后，经差速离心（7727 g离心10 min，482 g离心30 s）获得纯化的CnmeGV，以无菌水稀释至1×1010OB/mL后4 ℃保存备用。

根据预备试验结果，在人工饲料中均匀混入105OB/g的CnmeGV作为亚致死剂量（死亡率约20%）口服感染3 龄幼虫，2 d后更换未接病毒的饲料正常饲养，10 d后每重复中随机挑取8头幼虫用以检测病毒感染率、消化酶和解毒酶活性，其余部分继续饲养至子代产卵孵化。另以未接病毒的人工饲料饲养同龄幼虫为对照，每处理重复3次，每重复试虫80头。

1.3 稻纵卷叶螟生长发育与产卵

逐日检查记录感染病毒幼虫死亡数（不能正常化蛹的老熟幼虫视为死亡）、化蛹数及蛹重，绘制存活曲线，计算幼虫校正累计死亡率和发育历期。蛹羽化后记录羽化数、性比，并按照♀:♂＝1:1配对放入塑料杯中交配产卵，观察记录产卵数和孵化数，计算单雌产卵量及孵化率。

1.4 CnmeGV持续感染的检测

采用巢式PCR 方法检测CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟的带毒率[15]。取食CnmeGV 10 d的幼虫体表经10%甲醛消毒10 min，单头液氮研磨、700 μL裂解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.1 mol/L NaCl，0.008 mol/L EDTA，pH 10.7）37 ℃裂解10 min，加入7 μL蛋白酶K和1 μL Rnase酶55 ℃水浴30 min，酚氯仿抽提法提取 DNA。先用外侧引物 Cm-gran 1（F：TGATGCCGAGTATGAACCG；R：TTCCTCAACCTCTCCCGTA G）进行PCR扩增。扩增产物稀释100倍为模板，再用内侧引物Cm-gran 2（F：CGCATCACTCTGTTCAAGG；R：ACGAGAGGACGGTAGAAGTAG）扩增CnmeGV的granulin基因标记片段，1%琼脂糖电泳检测。

1.5 稻纵卷叶螟消化酶和解毒酶活性测定

消化酶主要检测虫体中肠蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性。饲养稻纵卷叶螟4龄幼虫在0～4 ℃下迅速解剖，截取中肠及其内含物，每处理解剖幼虫8 头，重复3次。以0.15 mol/L NaCl溶液在冰浴中匀浆，214 g、4 ℃离心15 min，取上清液作为测试用酶液。参照王琛柱等[17]以氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定总蛋白酶活性。淀粉酶活性的测定按照 3,5-二硝基水杨酸法进行[18]。脂肪酶活性的测定采用比色法[19]。

解毒酶主要测定羧酸酯酶（CarE）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽转移酶（GST）活性。剖去中肠的幼虫体加入5 mL预冷的0.04 mol/L磷酸缓冲液匀浆，离心（7727 g、4 ℃）15 min，取上清液作为测试用酶液。CarE和GST测定参考杨亚军[4]方法，用酶标仪分别在450 nm和340 nm波长测定间隔反应时间的光密度值（OD），以反应速率表示酯酶活性（OD/(min·mg)）。CAT活性采用二苯胺磺酸钠催化动力光度法，测定550 nm波长下酶促反应速率[20]。

1.6 稻纵卷叶螟激素水平和卵黄蛋白含量测定

蜕皮激素含量参考慧玉虎等[21]方法测定。幼虫称重后放入研钵，加2 mL 95%乙醇浸提，超声振荡30 min。将液体转移到2 mL离心管中，858 g冷冻离心10 min，用95%乙醇离心提取多次，集合上清液。经氮气吹干后用甲醇定容，液相色谱测定激素含量。保幼激素含量根据戴国华等[22]方法。幼虫称重后放入研钵，加甲醇与乙醚（1:1）混合液研磨，转移出液体，加入1 mL正己烷超声10 min，858 g冷冻离心10 min，取上清液，用正己烷提取3次汇集上清液。经氮气吹干后用乙腈定容，液相色谱测定激素含量。卵黄蛋白含量参考杨国庆等[23]，羽化成虫4 ℃解剖卵巢，吸干水分后称鲜重。加入5 mL PBS溶液匀浆， 4 ℃、7727 g离心20 min，取上清液考马斯亮蓝G-250染色测定。

1.7 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2016处理数据，发育历期采用t测验分析，存活曲线应用log-rank test分析，其余数据采用SPSS软件进行数据统计并方差分析，图形制作使用GraphPad Prism软件。

2 结果与分析

2.1 CnmeGV亚致死处理害虫的感染和死亡动态

105OB/g的CnmeGV亚致死剂量处理稻纵卷叶螟3龄幼虫后，存活幼虫能正常生长，并未表现出明显的病毒感染症状。病毒亚致死处理幼虫10 d后巢式PCR检测发现，虫体内普遍检测到500 bp大小CnmeGV的granulin基因片段存在，而未经病毒处理的对照组中未检测到病毒标记基因片段（图1）。说明亚致死剂量CnmeGV能够在稻纵卷叶螟虫体内长时间存在，幼虫体内始终携带感染病毒，从而产生亚致死作用。CnmeGV亚致死浓度下稻纵卷叶螟幼虫校正累计死亡率为 18.15%，处理组生存曲线与对照组呈显著差异（df＝1,P＝0.0431）。害虫感染CnmeGV死亡发生集中在病毒接种后期化蛹阶段（12～14 d），老熟幼虫不能正常化蛹而死亡（图2）。

图1 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟幼虫存活个体带毒水平的随机检测Fig. 1 Virus carrying in survival larvae of C. medinalis treated with sub-lethal dose of CnmeGV

图2 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟幼虫的存活动态Fig. 2 The survival curve of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

2.2 亚致死处理对稻纵卷叶螟生长和繁殖的影响

亚致死CnmeGV对稻纵卷叶螟的生长发育产生明显影响，主要表现在化蛹、羽化和产卵的变态阶段。CnmeGV亚致死浓度处理稻纵卷叶螟后，幼虫3龄后平均发育历期为13.68 d，而对照组为13.30 d，两者差异不显著（t＝1.393，df＝85，P＝0.1672）（图3）。幼虫化蛹蛹重显著下降，较对照减轻了15.95%（F1,5＝13.94，P＝0.02）。病毒亚致死处理对蛹的羽化产生明显影响，处理组蛹羽化率仅为59.21%，显著低于对照84.02%的羽化率（F1,5＝40.70，P＝0.0031），同时羽化成虫性比发生变化，处理组雌性性比（♀∶♂）由对照组的1.11下降到0.82（F1,5＝59.346，P＝0.002），差异显著（图4）。CnmeGV亚致死处理同样影响了稻纵卷叶螟的产卵，羽化成虫单雌产卵量为26.07粒，较对照产卵量减少了41.5%，差异显著（F1,5＝19.42，P＝0.0116）。而从产卵孵化率来看，处理组雌虫产卵孵化率达88%，与对照组93%的孵化率差异不显著（F1,5＝4.83，P＝0.0926）（图5）。

图3 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟幼虫的历期Fig. 3 Duration of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

图4 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟蛹重、羽化及性比的变化Fig. 4 Pupa weight, eclosion and sex ratio of C. medinalis treated with sub-lethal dose of CnmeGV

图5 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟的产卵和孵化Fig. 5 Oviposition and hatching of C. medinalis treated with sub-lethal dose of CnmeGV

2.3 CnmeGV亚致死处理对稻纵卷叶螟代谢酶活性的影响

CnmeGV亚致死处理影响稻纵卷叶螟幼虫的营养代谢，幼虫中肠脂肪酶活性变化最大，较对照处理活性提高了45.92%（F1,5＝90.23，P＝0.001）。淀粉酶活性从0.196提高到0.2833，显著高于对照处理（F1,5＝9.74，P＝0.0035），而蛋白酶活性与对照处理无显著差异（F1,5＝1.96，P＝0.234）（图6）。幼虫虫体羧酸酯酶（CarE）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽转移酶（GST）等解毒酶活性也表现不同程度的差异变化，CarE活性降低，与对照呈显著差异（F1,5＝25.08，P＝0.007），GST酶活性增强，显著高于对照处理（F1,5＝17.12，P＝0.014）。CAT酶活性与对照组相比差异不显著（F1,5＝1.91，P＝0.239）（图7）。

图6 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟幼虫消化酶活性变化Fig. 6 The digestive enzyme actives of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

图7 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟幼虫解毒酶活性变化Fig. 7 The detoxifying enzyme actives of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

2.4 亚致死处理对稻纵卷叶螟激素水平和卵黄蛋白的影响

稻纵卷叶螟取食亚致死浓度CnmeGV后，幼虫体内蜕皮激素和保幼激素含量显著降低，蜕皮激素含量由 0.188 μg/g 下降到 0.041 μg/g，降幅达 4.59 倍（F1,5＝19.77，P＝0.0069）。保幼激素由对照组的 0.146 μg/g下降为0.026 μg/g，下降了5.62倍（F1,5＝5.89，P＝0.0004）。CnmeGV亚致死处理对稻纵卷叶螟卵巢发育无显著影响（F1,5＝7.22，P＝0.7537），但卵巢内卵黄蛋白含量显著降低，处理组卵黄蛋白含量为235.17 μg/g，较对照下降了40.63%（F1,5＝37.75，P＝0.0388）（表1）。

表1 CnmeGV亚致死处理稻纵卷叶螟幼虫激素水平及成虫卵黄蛋白含量Table 1 The hormone level of C. medinalis larvae and vitellogenin content of female treated with sub-lethal dose of CnmeGV

3 讨论

杀虫剂的亚致死作用研究是害虫可持续治理和农药科学应用的重要课题。目前，有关亚致死效应主要通过生物个体的生物活性、繁殖率、生态行为或种群生命表等方面的参数来评价和评估[7]。基于化学杀虫剂的大量研究表明，亚致死作用对害虫的影响因农药性质、害虫种类、试验方法等不同而有所差异[24]。杆状病毒是特异性感染昆虫的环状双链DNA病毒，主要包括核型多角体病毒（NPV）和颗粒体病毒（GV），通过病毒粒子感染宿主受体细胞造成害虫死亡、引起害虫病毒流行而控制害虫种群暴发增长[25]。杆状病毒突破宿主免疫体系形成系统感染则造成害虫直接死亡，而宿主通过防御机制抑制病毒进一步增殖扩散而存活。作为其存活的代价，害虫往往通过降低存活率、延长发育历期、降低蛹重、减少产卵量等来维持对病毒感染的免疫抗性[26]。本研究结果表明，CnmeGV亚致死剂量处理后存活幼虫体内普遍携带病毒，可能造成稻纵卷叶螟种群中杆状病毒持续感染。持续感染的病毒虽不能造成稻纵卷叶螟幼虫的直接死亡，但却影响了稻纵卷叶螟的生长发育和产卵繁殖。CnmeGV亚致死处理害虫的蛹重、羽化、性比和产卵都发生明显变化，表现出蛹重减轻、羽化率下降、雌雄性比降低和产卵量减少，最终导致稻纵卷叶螟子代种群增长受到显著抑制。Rothman等[27]认为杆状病毒的亚致死作用在去掉其致死作用外，可使种群数量再降低20%。杆状病毒除通过直接致死昆虫外，也通过影响产卵率等因素影响宿主种群动力学[28]。

目前，有关杀虫剂对害虫的亚致死效应主要集中在害虫生物学特性的表象上，造成亚致死作用的内在机制仍无法明晰[7]。杆状病毒的亚致死效应可能更多是能量交换的结果，宿主为抵抗外源病毒而调动免疫反应将病毒感染的影响限制到最低水平，从而使自身的生长或其他重要功能不受影响[29]。CnmeGV亚致死处理对幼虫发育历期的影响不明显，但对消化酶活性影响显著，特别是淀粉酶活性显著增强。说明病毒亚致死效应诱导宿主通过提高消化酶活性增强取食代谢以补偿抵御病毒感染的能量消耗。CnmeGV对稻纵卷叶螟的亚致死作用主要表现在化蛹和羽化阶段。前期研究也表明，亚致死处理的稻纵卷叶螟在化蛹的变态过程中，通过蛹蜕将虫体内持续感染的病毒排出体外，以降低潜伏感染病毒对子代的影响[15]。胸腺是昆虫分泌蜕皮激素的主要结构，脑内神经分泌细胞也是多种激素产生和分泌的场所。NPV亚致死处理舞毒蛾Lymantria dispar的胸腺、脑和卵巢等组织都不同程度受到感染，可能影响昆虫分泌功能，导致生长发育紊乱[30]。CnmeGV亚致死处理后，稻纵卷叶螟调控昆虫变态发育的保幼激素和蜕皮激素水平都显著下降，影响了昆虫的正常变态发育，表现出蛹重降低，性比变化及羽化率显著下降。杆状病毒亚致死作用对雌性个体的影响明显高于雄性个体[30]。卵黄蛋白是卵黄中的主要成分，为胚胎发育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素等营养和功能性物质[23]。CnmeGV亚致死处理的雌性成虫卵巢中卵黄蛋白含量显著下降，这可能是导致CnmeGV亚致死处理羽化成虫产卵量下降的主要因素。

昆虫体内解毒酶的酶活力可以作为一种生物标记来测定杀虫剂的亚致死效应[31]。GST和CarE是对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系，多杀菌素在活体条件下能诱导增强虫体 CarE活性，从而降低害虫对杀虫剂的敏感度[32]。GSTs和CarE的活性增强与田间茶细蛾Caloptilia theivora的抗药性密切相关[33]。杆状病毒亚致死作用同样涉及宿主虫体抗性、解毒相关酶系的活性。美洲棉铃虫Helicoverpa zea经核型多角体病毒（HzSNPV）亚致死浓度（LD15）处理后诱导虫体参与包埋和黑化反应的葡糖水解酶（GLD）活性显著提高，而多酚氧化酶（PO）活性却未发生明显变化[34]。小菜蛾Plutella xylostella感染颗粒体病毒（PxGV）的虫体 CAT活力显著提高，而过氧化物岐化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活力变化较小[35]。本研究测定的三种解毒酶活性中，CAT活性在CnmeGV亚致死作用下并未发生明显变化，但GST活性显著提高，而 CarE活性却显著下降，说明杆状病毒亚致死作用诱导的免疫反应是复杂的，与宿主的抗逆性和耐药性有着密切的关系[36]。GST活性增强可能涉及宿主对病毒的抗性作用，CarE活性下降则表明宿主对杆状病毒抗性存在不同于化学农药的机制。杆状病毒感染诱导虫体组织产生氧化应激反应[37]，CnmeGV亚致死处理并未引起CAT活性改变，有利于虫体组织保持较高的活性氧（ROS）水平，从而抑制病毒的增殖。

杆状病毒作为控制害虫的重要生物因子，是引起生态系统中昆虫种群波动的主要因素，其作用价值在于对害虫种群的生态控制作用上[28]。杆状病毒感染宿主不仅具有杀死害虫的致死作用，还具有亚致死作用。这种亚致死作用表现为寄主体内带毒而不造成害虫死亡的持续感染。近年来大量证据表明，持续感染的杆状病毒在昆虫种群中普遍存在[38]，持续感染可能是造成亚致死效应的主要因素。长期以来对杀虫剂的评价主要集中在其致死剂量的杀虫效果和致死时间的长短，而没有表现出即时杀虫效果的亚致死作用常常被忽视。已有的研究充分证明，杆状病毒亚致死作用显著影响害虫的生长发育和产卵繁殖，对控制害虫种群增长具有重要作用[39,40]，加强杆状病毒亚致死作用在维持生态平衡、减少农药和病毒使用及对害虫种群持效控制作用研究具有重要意义。