解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵条件研究

王 翠，王 妍，戴蓬博，梁晓飞，张 荣，孙广宇*

（1. 西北农林科技大学植物保护学院，杨凌 712100；2. 河北农业大学植物保护学院，保定 071000）

随着我国农业现代化的发展，作物病害对产业可持续发展的不良影响日益凸显[1]。解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens是具有促生、保鲜等作用的有益微生物[2,3]，具有高效广谱的抑菌活性，因而受到人们越来越多的关注，一些优良菌株被作为生物农药及生物肥料开发利用[4]。王奕文等[5]从甜瓜果实表面分离到解淀粉芽胞杆菌，对灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、链格孢等病原真菌生长具有显著的抑制作用。彭研[6]从300株芽胞杆菌中筛选出NCPSJ7，该菌对西瓜枯萎病菌与桃根霉病菌有拮抗作用。大量的研究证明解淀粉芽胞杆菌抑菌活性主要是产生抗菌蛋白、脂肽类、聚酮类化合物等抗菌物质，如张迎等[7]从番茄根际分离出解淀粉芽胞杆菌W10，其分泌的抗菌蛋白可以有效控制番茄灰霉病和桃褐腐病发生；郭继平等[8]研究显示解淀粉芽胞杆菌N22发酵液中的蛋白成分可以有效控制葡萄霜霉病。Chen等[9]和Koumoutsi等[10]研究发现解淀粉芽胞杆菌 FZB42 产生的脂肽类物质可抑制病原真菌的生长，产生的聚酮化合物对由欧文氏菌Erwinia amylovora引起的梨火疫病具有防治效果；桑建伟等[11]研究发现内生解淀粉芽胞杆菌BEB17产生的脂肽类和聚酮类化合物通过破坏香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporumf. sp.cubenserace 4细胞膜起生防作用；Abdallah等[12]证明解淀粉芽胞杆菌 32a通过产生脂肽类抑制根癌土壤杆菌的生长达到防治番茄冠瘿病的目的。除此之外，Tan等[13]发现T5可以刺激番茄根际分泌有机酸，而有机酸募集更多有抑制枯萎病活性的生防菌。Siahmoshteh等[14]发现解淀粉芽胞杆菌可以降解黄曲霉毒素。因此，解淀粉芽胞杆菌在植物病害防治中具有重要的应用潜力。

研究高效、低成本的生产工艺是实现生防菌应用的前提[15,16]。信珊珊等[17]对解淀粉芽胞杆菌WH1发酵条件优化后，其抗菌脂肽的含量大幅上升，对油茶炭疽菌的防效显著提高。洪鹏等[18]对解淀粉芽胞杆菌HF01发酵条件优化后，抑菌能力提高 37.3%。刘京兰等[19]研究表明优化后抗菌脂肽的产量比优化前提高了4倍。这些研究表明，解淀粉芽胞杆菌的数量、代谢物成分等与培养基成分和发酵条件有关。解淀粉芽胞杆菌发酵条件的优化主要包括正交法、单因素筛选、响应面法、中心设计法、均匀设计发法等[20,21]。本研究室前期在苹果心室内分离并筛选出一株生防细菌解淀粉芽胞杆菌DP03-4，该菌株在室内对苹果腐烂病菌、霉心病原菌等多种苹果病原表现显著拮抗作用（未发表）。本文报道其优化后的培养和发酵条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciensDP03-4，粉红聚端孢Trichothecium roseum均由西北农林科技大学植保学院真菌实验室分离鉴定保存。

试剂：葡萄糖、蔗糖、氯化铵、硝酸钾、碳酸钙、氯化钠、磷酸氢钾等试剂为国产分析纯，麦芽糖、乳糖、淀粉、糊精、甘露醇、果糖、胰蛋白、酵母浸膏、蛋白胨、酪蛋白等为国产化学纯试剂。

LB培养基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉15 g；PDA培养基：马铃薯20 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，自来水1000 mL。

1.2 试验方法

菌株活化及种子液制备：将保存的DP03-4菌株在LB平板上划线培养后，用牙签蘸取适量菌体接种于100 mL LB液体培养基内，于28 ℃、180 r/min 的摇床内振荡培养24 h。

解淀粉芽胞杆菌DP03-4生长曲线测定：将1% DP03-4种子液接种于LB培养液中，每隔2 h用紫外分光光度计测量菌体培养液的OD600值，待菌体生长量平稳无明显变化时停止测量，重复3次，制作DP03-4的生长曲线[21]。

抑菌活性测定：取200 μL浓度为1×106分生孢子/mL的粉红聚端孢孢子悬浮液涂布PDA平板上，25 ℃培养6 h后，每皿中央各放置一个牛津杯，加入20 μL DP03-4发酵液，培养48 h后，测量抑菌圈直径。

最适培养基碳源、氮源和无机盐筛选：以酵母浸粉（氮源）10 g，氯化钠（无机盐）5 g，去离子水1000 mL的培养基为基础成分，后分别添加10 g葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇、果糖等不同碳源，制成不同碳源培养基；以最适碳源10 g，氯化钠（无机盐）5 g，蒸馏水1000 mL，分别添加10 g牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨、酸水解酪蛋白、胰蛋白、氯化铵、硝酸钾等制成不同氮源培养液；碳源、氮源确定后，在基础培养基里分别添加5 g碳酸钙、氯化钠、磷酸氢钾、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁等制成无机盐培养基。确定不同培养基组分的最适添加量范围后，对碳源、氮源和无机盐等进行三因素三水平的正交试验[16]。正交试验的培养条件为接种量1%，温度28 ℃，摇床转速180 r/min，装液量100 mL/250 mL，培养时间20 h。

培养条件筛选：以接种量、初始 pH、装液量、温度、转速等单因素为变量，固定其他因素，分别确定单因素最适条件。各因素水平设置如表1[22]。

表1 发酵条件单因素水平实验Table 1 Single factor experimental design of fermentation conditions

1.3 数据统计与分析

采用Excel、SPSS26软件对数据进行统计分析，采用Origin进行绘图。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽胞杆菌DP03-4生长曲线的测定

将保存的DP03-4菌株在LB平板培养活化，用牙签蘸取适量菌体接种于LB液体培养基内培养，将1% DP03-4培养液接种于LB培养液中，间隔2 h测量菌体生长量的OD值，制作生长曲线。结果显示，在接种后0～4 h 内细菌生长缓慢，4 h后细菌数量开始增加；6 h后进入快速增长阶段，到达16 h后增长速度减慢，18 h后趋于平稳，21 h后菌体开始减退（图1）。上述结果表明，8～12 h为解淀粉芽胞杆菌DP03-4的对数生长期，适合做种子液，本研究选取10 h的发酵液为发酵培养的种子液。

图1 解淀粉芽胞杆菌DP03-4在LB培养基中的生长曲线Fig. 1 Growth curve of Bacillus amyloliquefaciens DP03-4 in LB medium

2.2 解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵条件优化

2.2.1 解淀粉芽胞杆菌 DP03-4发酵培养基筛选分别在氮源、无机盐固定、碳源不同的培养液中培养DP03-4，通过菌体生长量和发酵液对粉红聚端孢的抑菌效果筛选最适碳源。结果显示，不同碳源对菌株生长及对粉红聚端孢抑菌效果均不同，其中以葡萄糖作为碳源的培养液中菌体生长量最多，OD600值为 2.27。麦芽糖对应的 OD600值与葡萄糖无显著差异，但发酵液的抑菌效果较葡萄糖弱，其他碳源包括蔗糖、淀粉、果糖、乳糖、糊精和甘露醇等所对应的 OD600值与抑菌活性均小于葡萄糖（图2），因此选择葡萄糖作为最适碳源。

图2 不同碳源对DP03-4发酵的影响及发酵液抑菌活性测定Fig. 2 Effects of different carbon sources on the fermentation of DP03-4 and inhibitory activities of fermentation solution

分别在葡萄糖含量分别为 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的培养基中培养菌株DP03-4结果显示，菌体的生长量在0.5%葡萄糖时OD600值达到最大值3.43，后随葡萄糖含量的增加而逐渐降低，抑菌活性在葡萄糖含量为1.0%时最高，对应的抑菌圈直径60.1 mm（结果未显示）。因此，选取葡萄糖水平为0.5%、1.0%、1.5 %进行正交试验。

在碳源、无机盐固定，氮源不同的培养液中培养DP03-4筛选最适氮源结果显示，在酵母浸粉作为氮源的培养液中菌体生长量最多，OD600为2.84；牛肉膏和酪蛋白对应的OD600值与酵母浸粉无显著差异，但二者对应的抑菌圈直径均小于酵母浸粉；胰蛋白和蛋白胨的 OD600值及抑菌活性都明显低于酵母粉；氯化铵和硝酸钾对DP03-4毒性较大，严重影响其生长（图3）；综合考虑以酵母浸粉为最适氮源。在酵母浸粉含量分别为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的培养液中，菌体的生长量随酵母浸粉含量的增加而逐渐增加，到1.5%后逐渐降低，其中在含量为1.5%时菌体量最多，OD600值为2.65时抑菌活性较强，抑菌直径为55.0 mm（结果未显示）。基于这些结果，将酵母浸粉水平设置为1.0%、1.5%、2.0%进行正交试验。

图3 不同氮源对DP03-4发酵的影响及发酵液抑菌活性测定Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of DP03-4 and fermentation solution inhibition activity

在碳源、氮源固定，无机盐不同的培养液中培养筛选最适无机盐，结果显示（图4）菌体生长量在磷酸氢钾与氯化钠培养条件下OD值最高为2.49，但相比磷酸氢钾，氯化钠的抑菌圈直径较高为48.3 mm，所以最佳无机盐选择氯化钠。解淀粉芽胞杆菌DP03-4在碳源、氮源固定，氯化钠含量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的培养基中，菌体的生长量随氯化钠含量的增加逐渐增加，后逐渐降低，在氯化钠含量达到0.5%左右时菌体量最多且抑菌活性较强（结果未显示），所以将氯化钠设置为0.25%、0.50%、0.75%进行正交试验。

图4 不同无机盐对DP03-4发酵的影响及发酵液抑菌活性测定Fig. 4 Effects of different inorganic salt on the fermentation of DP03-4 and inhibitory activities of fermentation solution

在碳源、氮源、无机盐的单因素水平试验基础上进行3因素3水平的正交试验，按正交表进行试验并对结果进行统计分析（表2），据极差R的大小，酵母浸粉对解淀粉芽胞杆菌DP03-4的菌体生长量、抑菌圈直径影响最大，葡萄糖次之，氯化钠对其影响最小，各因素主次顺序为BAC，最佳发酵培养基配方为：葡萄糖10 g，酵母浸粉15 g，NaCl 2.5 g，H2O 1000 mL。

表2 菌株DP03-4培养基的筛选正交试验结果Table 2 Design and results of single factor experiments on medium composition of the strain DP03-4

2.2.2 解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵条件筛选 培养液的初始pH值对菌体生长量的影响较大，酸性培养条件明显抑制DP03-4的生长，在pH为4时，菌体几乎不生长，在pH 5～7时菌体生长量最多，偏碱性培养条件下抑制其生长（图5）。因此，选择DP03-4的发酵初始pH值范围为6。

图5 不同pH对解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵的影响Fig. 5 Effects of different pH on the fermentation of B.amyloliquefaciens DP03-4

摇瓶装液量主要影响菌体的溶氧量，随着装液量的增多，溶氧量降低，菌体生长量也降低；但装液量太少会因培养液蒸发而影响菌体生长。解淀粉芽胞杆菌DP03-4在75 mL/250 mL时菌体生长量最多（图6），因此装液量选为75 mL/250 mL。

图6 不同装液量对解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵的影响Fig.6 Effects of different medium volume on the population of B.amyloliquefaciens DP03-4 in shake culture

菌体生长量受摇床转速的影响较小，在120～240 r/min呈先增加后降低的趋势，在转速为210 r/min时菌体生长量达到最大OD值2.34（图7），所以选择最适的摇床转速为210 r/min。

图7 DP03-4在不同摇床转速下菌体生长的OD值Fig. 7 Effects of different rotation speeds on the population of B.amyloliquefaciens DP03-4 in shake culture

温度对解淀粉芽胞杆菌DP03-4的影响较明显，随着温度的增加，菌体生长量呈先增加后降低的趋势，当温度处于30 ℃～35 ℃ 时菌体生长量最多，此时OD值为1.5左右（图8），所以温度控制在30 ℃～35 ℃。

图8 不同温度对解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵的影响Fig. 8 Effects of different temperature on the population of B.amyloliquefaciens DP03-4 in shake culture

解淀粉芽胞杆菌DP03-4菌体生长量随菌种接种量的增多先增加后降低，接种量在4%时菌体生长量最多，OD值为2.19，随后缓慢降低，接种量在2%～5%之间菌体生长量无显著差异（图9），综合考虑最适的接种量为4%。

图9 不同接种量对解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵的影响Fig. 9 Effects of different inoculum on the fermentation of B.amyloliquefaciens DP03-4

3 讨论

培养基成分和培养条件会对菌株的生长量和抑菌物质的分泌影响明显[19]。本研究通过培养基组分单因子试验和正交试验确定了培养解淀粉芽胞杆菌 DP03-4的最适碳源、氮源和无机盐及最适培养基配方。通过单因子水平试验确定了该菌株发酵条件的最适培养条件。与优化前相比，发酵液菌体量提高 43.7%，抑菌活性提高51.4%。为该菌株的后续发酵利用提供了基础数据。

研究发现，牛肉膏、酪蛋白、酵母粉、胰蛋白和蛋白胨等不同氮源的发酵液对抑菌活性差异不大，但是对解淀粉芽胞杆菌的菌体产量影响较大。如以酪蛋白为氮源，菌体产率仅为酵母粉的三分之一，说明氮源种类显著影响解淀粉芽胞杆菌DP03-4菌体生长，其机理有待进一步解析。洪鹏等[18]研究显示以氯化铵为氮源不利于解淀粉芽胞杆菌生长，推测铵态氮源难以被利用，且对菌体生长有一定的抑制作用。在本研究中，以无机氮氯化铵为氮源，该菌株几乎不生长，表现出对其生长的“毒性”，可能与氯离子的存在有关。