苁归益肾胶囊对DKD大鼠血管内皮损伤的保护作用及VCAM-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响

刘俊峰，孙晓娟，吴 迪，朱梦燕，方朝晖＊

（安徽中医药大学1研究生院，2第一附属医院内分泌科,合肥 230012）

糖尿病（DM）是常见的慢性非传染性疾病，目前认为是由胰岛素功能障碍引起的代谢紊乱综合征,具有病程长，难治愈的特点,临床上以T2DM多见,占DM的90%左右［1］。祖国传统医学认为T2DM属于“消渴”病，其病变机理主要是阴虚燥热。病程日久，迁延不愈，阴损及阳，肾阳衰微，加之机体阴虚燥热，耗液伤津，逐渐发展为脉络瘀阻。西医则认为，持久的高血糖可导致血管斑块、动脉粥样硬化及血管壁点状钙化等血管病变。有研究发现T2DM患者的死亡约50%是血管并发症引起的，作为T2DM常见的血管并发症之一的糖尿病肾病（DKD）是由糖尿病引起的肾脏微血管病变[2-3]。糖代谢紊乱与内环境高糖状态是DKD发病的主要病因，细胞凋亡参与了DKD发生的整个过程。苁归益肾胶囊是安徽中医药大学第一附属医院研制的具有温阳益肾、活血调脂之功效的中药复方制剂,前期研究发现苁归益肾胶囊能改善血糖血脂、改善肾功能及胰岛素抵抗，减轻机体凋亡反应［4-5］。本研究从氧化应激和细胞凋亡角度阐述苁归益肾胶囊对DKD大鼠血管内皮损伤、肾组织结构的保护作用及VCAM-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物50只8周龄健康的SPF级雄性Wistar大鼠，体重(220.7±3.5)g，购于安徽医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SCXK-(皖)2018-002。动物房饲养，保持温度22~25℃，相对湿度45%~60%，黑暗和光照交替，各12 h。本实验经过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查批准[AHUCM(rals)2018009]。

1.2 药物和仪器苁归益肾胶囊组成药物为(肉苁蓉15 g、当归12 g、山茱萸12 g、淫羊藿9 g、泽泻9 g、丹皮12 g)，安徽中医药大学第一附属医院（安徽省中医院院内制剂，批号20130925）。链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司），盐酸吡格列酮片（天津武田药品有限公司），NO、MDA、T-AOC、SOD、GSH-Px试剂盒（南京建成生物工程研究所），ET、VCAM-1、MCP-I、OxLDL、AGEs ELISA试剂盒（武汉博士德生物有限公司），转膜仪（美国Biorad公司），凝胶成像分析仪（美国Biorad公司），透射电子显微镜（日本日立公司H-7500）。

1.3 饲料标准饲料以及高糖高脂饲料（0.25%胆酸钠、1.5%胆固醇、10%猪油、5%蔗糖、普通大鼠饲料83.25%）由安徽医科大学实验动物中心配制。

1.4 方法

1.4.1 造模 随机选取健康雄性SPF级Wistar大鼠40只予以高糖高脂饲料喂食，适应性喂养1月后，按大鼠体重，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，注射72 h后尾静脉取血，并收集大鼠24 h内的尿液，检测各组大鼠空腹血糖及24 h尿蛋白定量，以连续3次血糖达到并超过16.7 mmol/L，24 h尿蛋白定量>30 mg为建模成功[6]。

1.4.2 分组及给药方法 将40只建模成功的DKD大鼠分为模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组，每组各10只，继续高糖高脂喂养；10只正常大鼠作为对照组，予以普通动物饲料喂养。予以苁归低剂量组0.54 g·kg-1·d-1和高剂量组大鼠1.08 g·kg-1·d-1苁归粉末溶液灌胃，对照组和模型组大鼠则给予等容量的生理盐水灌胃，吡格列酮组大鼠给予吡格列酮片10 mg·kg-1·d-1灌胃治疗，喂养8周。

1.4.3 取材 第8周末，各组大鼠灌胃后禁食12 h，全部予以腹腔注射10%浓度的水合氯醛溶液麻醉，剂量为3 mg/kg。固定后迅速取出腔静脉血，离心血清，－20℃保存。置于液氮保存大鼠肾脏组织，用以制备检测细胞间黏附因子-1（VCAM-1）、bcl-2相关的X基因(Bax)、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、半胱天冬酶（Caspase-3）蛋白的表达。浸于4%甲醛溶液中固定大鼠肾脏组织，室温下保存，以备HE染色法观察。

1.5 检测指标

1.5.1 血管内皮功能、氧化应激及炎症等指标检测 硝酸盐还原酶法测定血清一氧化氮(NO)含量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清内皮素(ET)、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、晚期糖基化终末产物(AGEs)、血管内皮细胞黏附分子－1(VCAM－1)、MCP－1含量,硫代巴比妥酸分光光度法测定丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(TAOC)水平,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,紫外分光光度法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)活性。

1.5.2 肾脏组织蛋白表达的检测 应用Western-blot法，提取肾脏组织VCAM-1、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白进行检测，电泳分离，转膜，一抗并5℃冰箱内过夜，二抗孵育1h后显色曝光，图像分析。

1.6 统计学处理采用SPSS 23.0软件包进行数据分析，满足正态分布与方差齐性采用独立样本t检验，多重比较采用单因素LDS检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，不满足正态分布则应用非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血管内皮功能变化与模型组比较，对照组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组血清NO均升高（P＜0.05）、ET均降低（P＜0.05）;与对照组比较，模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组NO、ET差异均有统计学意义（P＜0.05）；与苁归高剂量组比较，模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组NO、ET差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清NO、ET水平比较/（±s ）

表1 各组大鼠血清NO、ET水平比较/（±s ）

注：与模型组比较，*P＜0.05;与苁归高剂量组比较，#P＜0.05；与对照组比较，▲P＜0.05。

分组对照组模型组吡格列酮组苁归低剂量组苁归高剂量组F P n 10 10 10 10 10 NO/（μmol/L）82.1±10.31*28.25±11.11#▲52.94±12.04*#▲45.52±9.60*#▲63.10±10.90*▲31.36＜0.01 ET/(ng/L）104.78±20.51*220.77±20.86#▲145.85±22.93*#▲148.23±20.77*#▲115.57±16.90*▲42.30＜0.01

2.2 各组大鼠肾脏组织病理的形态学改变对照组肾组织结构正常，基底膜无增生、纤维化，毛细血管腔清晰。模型组肾基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀甚至坏死。细胞质内可见红色颗粒、空泡改变、轻度间质纤维化和炎性细胞浸润。与模型组比较，苁归低、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞变性、模糊、肿胀，毛细血管轻度狭窄，但炎性细胞浸润明显减少。见图1。

图1 光镜下观察各组大鼠肾脏组织病理改变(×200)

2.3各组大鼠血清氧化应激指标变化与模型组大鼠比较，对照组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组MDA、oxLDL、AGEs水平降低（P＜0.05），T-AOC、SOD、CSH-Px水平升高（P＜0.05）；与对照组比较，模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组MDA、oxLDL、AGEs、T-AOC、SOD、CSH-Px差异均有统计学意义（P＜0.05）；与苁归高剂量组比较，吡格列酮组、苁归低剂量组、模型组MDA、oxLDL、AGEs、TAOC、SOD、CSH-Px差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠氧化应激指标水平比较/（±s ）

表2 各组大鼠氧化应激指标水平比较/（±s ）

注：与模型组比较，*P＜0.01;与苁归高剂量组比较，#P＜0.05;与对照组比较，▲P＜0.05。

分组对照组模型组吡格列酮组苁归低剂量组苁归高剂量组F P n 10 10 10 10 10 MDA/(mmol/L)13.16±4.98*33.07±9.02#▲22.47±8.05*#▲22.82±9.02*#▲15.51±5.11*▲9.81＜0.01 T-AOC/(mmol/L)2.28±0.31*0.70±0.24#▲1.40±0.30*#▲1.36±0.26*#▲1.81±0.23*▲42.55＜0.01 SOD/(U/mL)362.74±58.70*119.60±22.64#▲246.23±40.58*#▲264.05±26.24*#▲343.78±23.07*▲58.18＜0.01 CSH-Px/(U/mL)2602.85±325.60*1211.05±240.33#▲1892.16±224.82*#▲2095.28±236.86*#▲2348.46±194.89*▲37.44＜0.01 oxLDL/(ng/L)16.93±3.71*39.35±4.23#▲31.61±3.64*#▲33.77±3.25*#▲24.48±5.53*▲40.93＜0.01 AGEs/(ng/L)2.22±0.39*4.82±0.27#▲3.80±0.22*#▲3.85±0.28*#▲3.07±0.30*▲96.51＜0.01

2.4 各组大鼠血清VCAM-1、MCP-1变化与模型组比较，对照组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组血清VCAM-1、MCP-1均显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组VCAM-1、MCP-1差异均有统计学意义（P＜0.05）；与苁归高剂量组比较，对照组、吡格列酮组、苁归低剂量组、模型组血清VCAM-1、MCP-1差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清VCAM-1、MCP-1水平比较/（ng/L，±s ）

表3 各组大鼠血清VCAM-1、MCP-1水平比较/（ng/L，±s ）

注：与模型组比较，*P＜0.05;与苁归高剂量组比较，#P＜0.05;与对照组比较，▲P＜0.05。。

分组对照组模型组吡格列酮组苁归低剂量组苁归高剂量组F P n 10 10 10 10 10 VCAM-1 53.32±6.08*#85.38±4.14#▲73.43±4.27*#▲69.70±2.91*#▲65.14±6.21*▲51.20＜0.01 MCP-1 43.12±4.76*#68.38±5.50#▲58.75±4.03*#▲57.87±2.02*#▲53.55±5.04*▲39.72＜0.01

2.5 各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况与模型组比较，对照组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组、苁归高剂量组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；与苁归高剂量组比较，对照组、模型组、吡格列酮组、苁归低剂量组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图2。

表4 各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况比较

图2 各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达

3 讨论

DKD是糖尿病常见的并发症，其本质是一种糖尿病微血管病变，DKD患者往往伴有血清cys-c、ACR及血脂TC、TG、LDL-C等指标异常，大约40%的DKD患者在漫长的糖尿病病程中可能发展成为肾衰竭[7]。苁归益肾胶囊选用当归、肉苁蓉、山茱萸、桂枝、牡丹皮和泽泻，是根据中医基础理论及现代药理学理论研制出来的成果。此方中以当归、肉苁蓉共同为君药，其意在肉苁蓉可以补肾温阳、助气行血，当归补血活血。桂枝、山茱萸为臣药，意在桂枝温通补肾阳，助气行血化瘀，山茱萸性温，具有补肝益肾的功效，同时又可助当归、肉苁蓉益气活血升阳。丹皮、泽泻为方中佐药，意在二者皆性寒凉，可制约君药及臣药的温热之性。

DKD患者最终多死于大血管病变。NO和ET是反映血管内皮功能的重要指标，ET是一种强烈的缩血管肽，可促进细胞外基质合成及细胞增殖，参与机体因缺血、缺氧等导致的血管内皮细胞损伤过程，NO有舒张血管的作用，NO和ET是血管内皮损伤的重要标志物，一般情况下两者处于动态平衡状态，一旦二者之间失去平衡，必然会导致血管内皮损伤[8-9]。本研究显示，与模型组比较，苁归低剂量组、苁归高剂量组血清NO均升高、ET均降低。提示苁归益肾胶囊能够减轻血管内皮损伤。

氧化应激是内皮细胞损伤的重要机制，也是DM的重要致病因素［10］。氧化应激的发生与多种因素有关，高糖、高脂、低氧、oxLDL因子等直接或间接的作用于内皮细胞，导致SOD活性下降，抗氧化能力损伤，过氧化物生成增多[11-12]］。本研究发现，苁归高剂量组大鼠肾脏组织相较于模型组大鼠，肾脏损伤程度较轻，肾脏炎症因子表达也明显降低。提示，苁归益肾胶囊可以加强DKD大鼠体内的抗氧化能力，调节DKD大鼠体内氧化应激反应，达到保护DKD早期大血管内皮损伤、减轻高血糖带来的肾脏损伤。

已有研究表明，DKD的发生发展及修复过程都伴随着细胞凋亡[13]。凋亡是是受基因调控的一种细胞死亡。DKD早期，机体通过细胞凋亡清除多余增生细胞，对糖尿病肾脏有修复的作用；后期随细胞凋亡数增多，机体无法清除更多的增生细胞时会造成肾脏损伤。Bax是拮抗Bcl-2的促凋亡因子，Bax的上调会加速细胞死亡，Bcl-2上调有助于细胞存活[14]。Caspase-3高糖情况下被激活，Caspase-3最后执行凋亡，起着十分关键的作用[15]。本研究发现，与模型组比较，苁归高、低剂量组DKD大鼠Bax和caspase-3表达降低，Bcl-2表达升高。提示，苁归益肾胶囊可通过抑制DKD大鼠肾脏组织细胞凋亡，下调促凋亡的Bax、Caspase-3蛋白水平，上调抑制凋亡的Bcl-2蛋白水平，减少了肾脏细胞凋亡，减轻肾脏损伤，达到保护肾脏的效果。

综上，苁归益肾胶囊对DKD血管内皮损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制VCAM-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达有关。本研究因研究时间及场地设施的限制，研究的动物模型数量较少，且没有开展相关临床试验，没有深入研究电镜下DKD大鼠模型的肾脏组织细胞病理超微结构的改变；此外，未对苁归益肾胶囊的药物的各有效成分进一步分析，这些不足有望后期研究进一步完善。