新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素提取与测定

李青卓，张 楠，梅兴国，吴基良*

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.咸宁市康健医药产业园)

β-胡萝卜素是自然界普遍存在的天然色素之一，可作为着色剂应用于饮料、糖果及人造奶油当中。β-胡萝卜素是维生素A的前体，在体内转化为维生素A，用于治疗夜盲症，并且在临床前和临床研究中已被证明没有蓄积毒性[1]。β-胡萝卜素可以凭借其抗氧化特性抑制某些癌症(如乳腺癌、肺癌结肠癌)及其他疾病(如年龄相关性黄斑变性)的发生[2-3]，还可以预防糖尿病及心血管疾病，提升机体免疫力，从而增强疾病抵抗力，改善健康状况[4]。螺旋藻中含有丰富的β-胡萝卜素，约为700～1 700mg/kg[5]。

螺旋藻(spirulina，SP)是一种低等的自养型生物，在显微镜下呈不分枝的螺旋状；在分类上属于蓝藻门、颤藻亚目、颤藻科、螺旋藻属[6]，可被用于生物修复、硝化[5，7]和二氧化碳固定[8]。螺旋藻中除了含有丰富的蛋白质和几乎所有必需氨基酸外，还有维生素、γ-亚麻酸、矿物质等其他活性成分，近年来被用于营养食品补充剂[9]，被称为“21世纪最理想的食品”[10]。

目前现市场上螺旋藻食品或药品都是由新鲜螺旋藻经喷雾干燥后的螺旋藻粉加工制作，可能造成螺旋藻中β-胡萝卜素的损失。本实验通过正交试验研究提取螺旋藻的最佳条件，分光光度法测定并比较新鲜螺旋藻与螺旋藻藻粉中β-胡萝卜素的含量，为螺旋藻的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

ME1 002电子天平(梅特勒)，KH5 200超声波振荡器(昆山禾创超声仪器有限公司)，HJ-A4恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)，LD5-2B离心机(北京雷波尔医疗器械)，TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

新鲜螺旋藻由湖北省真奥金银花研究院提供；螺旋藻藻粉(云南施普瑞生物工程有限公司)冷藏备用；无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚均为分析纯(常熟市鸿盛精细化工有限公司)；β-胡萝卜素标准品(上海麦克林生化科技有限公司，纯度>96%)。

1.2 方法

1.2.1 波长选择

用石油醚作为溶剂溶解一定量的β-胡萝卜素标准品，在波长200～850nm范围内，用紫外可见分光光度计进行全波长扫描，获得β-胡萝卜素的特征吸收峰。

1.2.2 提取剂选择

分别以无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和石油醚作为提取剂浸提4h，用紫外分光光度计进行全波长扫描，与对照品波长进行比较，确定提取是否成功。

1.2.3 β-胡萝卜素标曲绘制

依据文献[11]配置一系列β-胡萝卜素标准溶液，以石油醚为空白溶剂，在450nm测定吸光度，绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.4 新鲜螺旋藻中含水量测定

取适量新鲜螺旋藻，经纱布反复过滤、洗净、抽滤，将螺旋藻搓至直径为3～5mm的条状，置于培养皿中，将其放于80℃真空干燥箱中烘干，研磨至粉末，得螺旋藻藻粉。依据《中国药典第四部》[12]中水分测定法中的烘干法测定水分，按下列公式计算新鲜螺旋藻含水量。螺旋藻藻粉含水量用快速水分测定仪测定。

式中：

W：新鲜螺旋藻含水量，单位为克每百克(g/100g)；

m1：新鲜螺旋藻及培养皿重量，单位为克(g)；

m2：螺旋藻烘干后及培养皿重量，单位为克(g)；

m3：培养皿重量，单位为克(g)；

100：换算系数。

1.3 提取方法优化

1.3.1 超声时间选择

称取新鲜螺旋藻藻泥0.5g(相当于0.1g螺旋藻藻粉)，加入10mL提取剂，用功率200W的超声波振荡器，分别超声0、5、10、15、20min，置于35℃恒温水浴锅中加热4h，离心取上清液定容于25mL棕色容量瓶中，测定β-胡萝卜素的吸光度。

1.3.2 提取剂体积选择

称取新鲜螺旋藻藻泥0.5g，分别加入5、10、15、20、25mL提取剂，超声10min，置于35℃恒温水浴锅中加热4h，离心取上清液定容于25mL棕色容量瓶中，测定β-胡萝卜素的吸光度。

1.3.3 提取温度选择

称取新鲜螺旋藻藻泥0.5g，加入10mL提取剂，超声10min，分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃恒温水浴锅中加热4h，离心取上清液定容于20mL棕色容量瓶中，测定β-胡萝卜素的吸光度。

1.3.4 浸提时间选择

称取新鲜螺旋藻藻泥0.5g，加入10mL提取剂，超声10min，置于35℃恒温水浴锅中，分别加热4、6、8、10、12h，离心取上清液定容于25mL棕色容量瓶中，测定β-胡萝卜素的吸光度。

1.4 正交试验设计

采用L9(34)正交试验表，以石油醚为提取剂，选取超声时间(A)、提取剂体积(B)、浸提温度(C)、浸提时间(D)4个因素，每个因素取3个水平，其因素水平见表1。

表1 正交试验因素表

1.5 螺旋藻中β-胡萝卜素含量测定

分别称取新鲜螺旋藻藻泥0.5g，螺旋藻藻粉0.1g，在正交试验所得的最优条件下进行提取实验，用紫外分光光度计测定样品吸光度，代入线性回归方程求β-胡萝卜素含量。

1.6 统计学方法

本研究首先利用单因素实验分别探讨了超声时间、提取剂体积、提取温度、浸提温度与β-胡萝卜素提取效果的相关关系，在此过程中利用EXCEL图标进行描述统计，最后通过正交试验进行提取方法优化。在结果计算时首先绘制标准曲线，进行线性回归分析，利用回归方程求取样品含量。

2 结 果

2.1 β-胡萝卜素吸收光谱

β-胡萝卜素在200～850nm范围内的吸收光谱如图1所示。由图1可知，β-胡萝卜素在450nm和480nm处均有较大吸收，在450nm处有最大吸收，是β-胡萝卜素的特征吸收峰，因此，本试验选择450nm作为β-胡萝卜素的测定波长。

图1 β-胡萝卜素对照品全波长扫描

2.2 提取剂选择

分别以丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯和石油醚作为提取剂提取新鲜螺旋藻中的β-胡萝卜素，并进行全波长扫描，结果如图2所示。由图2可知，以丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯作为提取剂进行全波长扫描时，最大吸收在437nm左右，并且偶尔会出现450nm处吸收峰消失的情况；以石油醚作为提取剂进行全波长扫描时，最大吸收在450nm处，且稳定，因此，选择石油醚作为提取剂。

图2 提取剂对提取效果的影响

2.3 标准曲线制作

β-胡萝卜素的标准曲线如图3所示。由图3可得，β-胡萝卜素浓度(C)在0～3μg/mL浓度范围内线性良好，线性回归方程为A=0.2 321C-0.0 006，R2=0.9996。

图3 β-胡萝卜素标准曲线图

2.4 新鲜螺旋藻中含水量测定

经计算，新鲜螺旋藻含水量达80%，烘干后螺旋藻藻粉含水量达5.44%，购买的螺旋藻藻粉含水量达6.67%(<7%)，符合国家食品标准中食用螺旋藻藻粉水分限定。

2.5 提取方法优化

2.5.1 超声时间对提取效果的影响

在样品浸提之前超声0、5、10、15、20min，计算试样中β-胡萝卜素含量，如图4所示。结果显示，超声可以显著提升新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素的含量，且在10min以后含量上升速度减缓。

图4 超声时间对提取效果的影响

2.5.2 提取剂体积对提取效果的影响

新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素的含量随着提取剂体积的增加呈现先增加后减少趋势，如图5所示。在15mL时含量水平最高，为64.72mg/100g，超过15mL时含量逐渐减少，由此可见提取剂体积对螺旋藻中β-胡萝卜素含量的提取也有一定影响。

图5 提取体积对提取效果的影响

2.5.3 提取温度对提取效果的影响

新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素的含量随着温度的升高先增加后降低，如图6所示。在40℃时提取效果最好，为64.80mg/100g，因此，选择40℃作为最佳提取温度。

图6 提取温度对提取效果的影响

2.5.4 浸提时间对提取效果的影响

新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素的含量随着浸提时间的增长而提高，如图7所示。在8h以后提取效果增加减缓。

图7 浸提时间对提取效果的影响

2.6 正交试验

新鲜螺旋藻中有关β-胡萝卜素提取效果的正交实验(表2)如下。结果显示，对新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素提取效果的影响因素：超声时间(A)>浸提温度(C)>浸提时间(D)>提取剂体积(B)，最优提取工艺为超声20min，石油醚15mL，提取温度35℃，浸提时间10h。

表2 正交试验结果分析

2.7 螺旋藻中β-胡萝卜素含量

分别称取新鲜螺旋藻藻泥0.5g，螺旋藻藻粉0.1g，在15mL石油醚中超声20min，于35℃中浸提10h，在450nm处测定样品吸光度，计算得新鲜螺旋藻和螺旋藻粉中的β-胡萝卜素含量分别为177.95mg/100g和117.40mg/100g。

3 讨 论

目前对β-胡萝卜素的提取溶剂存在很大差异，本实验证明丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯对β-胡萝卜素的提取有不良影响，故只采用单溶剂进行提取。而提取物吸收峰偶尔消失是β-胡萝卜素的偏移还是其他物质，以及混合溶剂是否更有益于β-胡萝卜素的提取需进一步研究。

本实验因为仪器限制原因使用固定功率超声波振荡器，未探究超声功率对β-胡萝卜素提取效果的影响。

目前β-胡萝卜素的测定方法主要有纸层析法、薄层层析法、柱层析法、分光光度法、高效液相色谱法等[13]。本实验采用分光光度法对β-胡萝卜素进行含量测定，因其方法简单，快捷高效，且本实验主要是用于新鲜螺旋藻与螺旋藻粉的比较，对其准确度要求不高。

通过正交实验得到提取螺旋藻中β-胡萝卜素的最佳提取工艺为以石油醚为提取溶剂，提取剂体积15mL，超声20min，提取温度35℃，浸提10h。在此条件下提取新鲜螺旋藻和螺旋藻粉中的β-胡萝卜素，测定含量分别为177.95mg/100g和117.40mg/100g，说明螺旋藻藻粉中β-胡萝卜素含量损失极大。

由上述实验结果可知新鲜螺旋藻中β-胡萝卜素的含量远大于螺旋藻藻粉，所以若将螺旋藻作为辅助治疗时，新鲜螺旋藻的效果可能比螺旋藻粉要好很多。且因本实验主要在比较新鲜螺旋藻与螺旋藻粉中β胡萝卜素的含量差异，所以提取溶剂未考虑其毒性，若要对其中的β-胡萝卜素进行提取应用则要更换溶剂或提取方法，也可考虑对石油醚进行剔除。