铁死亡在睾丸损伤中的研究进展

2022-12-31查文良

湖北科技学院学报(医学版) 2022年4期

赵倩，查文良

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北咸宁 437100；2.湖北科技学院附属第二医院)

多种原因可导致男性睾丸损伤，如接触有毒物质、疾病所触发的并发症等。铁死亡是铁依赖的，以细胞内脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆积为特征的细胞死亡形式。睾丸损伤时会出现类似铁死亡的表现，如铁代谢紊乱、ROS增加等。本文拟对铁死亡在睾丸损伤中的作用及机制进行综述。

1 铁死亡概述

铁死亡是一种由致命的脂质过氧化引起的细胞死亡形式，其所触发的细胞死亡可被铁螯合剂(如去铁胺)、亲脂型抗氧剂、脂质过氧化抑制剂(liproxstatin-1)和多不饱和脂肪酸的消耗所抑制[1]。

尽管初步研究表明，铁死亡在形态、生化和遗传上都不同于凋亡、坏死和自噬[2]，但大多数研究者认为发生铁死亡的细胞通常表现为坏死样的形态学改变[3]。铁死亡可表现为铁离子水平的异常、线粒体膜致密、线粒体嵴减少或消失、线粒体外膜破裂、细胞核大小正常，但染色质缺乏凝集[4]。

铁死亡主要受谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和半胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统Xc(System Xc)两个核心因子的调控。具体调节机制如下：①GPX4作为一种磷脂氢过氧化物酶，将高毒性磷脂过氧化物(AA/AdA-PE-OOH)转变为相应的无毒性的磷脂醇(PLOH)。GPX4的表达活性由硒和谷胱甘肽(GSH)控制[5]。②System Xc：其是由轻链溶质载体家族7成员11(SLC7A11)与重链溶质载体家族3成员2(SLC3A2)组成的异二聚体，调控胱氨酸与谷氨酸的互换，其被阻断时，可出现谷胱甘肽合成减少、氧化应激增加、脂质过氧化增加，进而诱导细胞死亡[6]。

目前，铁死亡的相关机制仍未完全阐明，但其在各种疾病中被广泛研究。如帕金森、心力衰竭、急性肾损伤等[7-9]。同时，铁死亡与生殖系统损伤的研究近几年也层出不穷，所以干预铁死亡可能成为防治生殖系统损伤的新措施。

2 铁死亡与睾丸损伤

在各种因素的刺激之下，不论是毒性物质的暴露(如亚砷酸钠)[10]，或是疾病带来的长期内环境的紊乱(如糖尿病)，均可引起睾丸组织功能和结构的异常。表现为睾丸的组织学改变如睾丸的帽状组织，体和尾状区域的质量减少、立体纤毛减少、上皮细胞聚集等；也可表现为睾丸功能水平的异常如神经内分泌调节紊乱、生精及射精功能障碍等[11]。近年来，铁死亡在生殖系统中的作用也引起了学者们的广泛关注。关键性因子GPX4在精子发生等过程起重要作用，这提示铁死亡在睾丸损伤中可能扮演重要角色。

2.1 影响铁代谢

细胞内存在铁稳态，铁离子的调节对铁死亡影响深远。肝脏合成的铁调素直接调控血清铁的水平，而细胞内铁稳态的调节主要依靠铁调控蛋白系统。体内Fe3+与转铁蛋白(Tfrc)结合，通过转铁蛋白受体1(TFR1)介导进入内核，Fe3+被STEAP3亚铁还原酶还原为Fe2+。最后经二价金属转运蛋白1(DMT1，也称SLC11A2)将Fe2+释放进入不稳定的铁池中，多余的铁储存在铁蛋白中。铁蛋白是一种由铁蛋白轻链多肽(FTL)与铁蛋白重链1(FTH1)构成的复合物。此外，膜铁转运蛋白(Fpn)是铁调素的受体，可以调控铁向细胞外释放[4]，部分Fe2+再经过氧化变成Fe3+继续体内铁循环。

睾丸缺血再灌注(I/R)损伤可诱导生殖细胞和支持细胞的死亡，相对的抑制细胞死亡可改善急性睾丸I/R损伤。通过构建氧糖剥夺/再灌注组(OGD/R)细胞模型，与正常的Sertoli细胞对比，研究发现该模型导致的睾丸缺血再灌注损伤可能通过降低Fpn的表达而减少铁的输出从而诱导铁死亡的发生，但在Tfrc、TFR1、DMT1、储铁蛋白未观察到表达差异性，表明缺血再灌注损伤通过减少铁的降解，并未改变铁的摄入而诱导铁死亡[12]。男性吸烟患者精浆中亦可见铁水平异常，细胞呈现铁死亡特征[13]。在暴露于化疗药物白消安的小鼠与应用Ferrostatin-1(Fer-1)，DFO(去铁胺)组相比，Fer-1、DFO组使得FPN1明显上调，TFR1表达下降，DMT1无表达差异性，说明在其损伤中通过影响FPN的表达来抑制铁死亡[14]。暴露于亚砷酸盐的小鼠中可见亚砷酸盐以相对剂量依赖性的方式显著提高了总铁和Fe2+的浓度，Tfrc、SLC11A、FTH1表达均有增加[10]。

2.2 影响脂质过氧化

铁死亡需要脂质ROS的产生，与多种过程相关，包括NADPH(还原型辅酶Ⅱ)介导的脂质过氧化、Fenton反应产生的铁依赖性ROS和GSH的耗竭。脂质过氧化是铁死亡的重要环节。

2.2.1 GPX4失活

GPX4在精子形成过程中起着重要作用。GPx4有三种类型：mGPx4主要转运至线粒体、nGPx4主要定位于核仁、cGPx4主要分布于细胞质和细胞核。研究发现，睾丸组织中mGPX4 mRNA和nGPX4 mRNA的表达明显高于其他组织[14]。尤其是精子发生期间，睾丸中mGPx4 mRNA和nGPx4 mRNA的表达显著，诱导实验中mGPX4 KO小鼠由于线粒体结构损伤而表现出雄性不育，但睾丸中精子数量正常。mGPx4与nGPx4起始密码子突变转基因可以挽救所有GPx4 KO小鼠的胚胎致死率，而cGPx4起始密码子突变转基因不能挽救胚胎致死率，证实其对小鼠胚胎发育和正常生长至关重要。所有GPx4 KO小鼠的精母细胞均表现出睾丸中生精细胞的严重缺陷，精子数量明显降低，鞭毛和精子线粒体结构异常，导致不育。所有GPx4 KO小鼠给予维生素E治疗可挽救小鼠精子发生的缺陷，从而恢复精子数量[15]。

另有研究发现吸烟会影响男性精液的质量，应用GC-2细胞株暴露于香烟凝雾冷凝物(CSC)中进行造模，并与正常GC-2组、GC-2+CSC+Fer-1组、GC-2+CSC+Z-VAD-FMK组进行对比，观察到，GSH与GPX4在CSC处理24h后显著降低并在Fer-1处理的细胞株中升高，提示吸烟与精浆中高水平的铁死亡有关，并影响经精子质量[16]。

2.2.2 System XC

System XC-：其由轻链溶质载体家族7成员11(SLC7A11)与重链溶质载体家族3成员2(SLC3A2)组成的异二聚体，影响GSH的含量，进而影响脂质过氧化。研究发现[10]，亚砷酸盐诱导的小鼠睾丸氧化损伤主要来自线粒体脂质过氧化，细胞水平(GC-2)表现出铁死亡现象，经过亚砷酸盐处理后，导致睾丸中的SLC7A11蛋白表达下降，GSH耗尽，影响GPX4活性，触发铁死亡。同时，在p533KR/3KRXRCC4-/-小鼠的脾脏和睾丸中亦可见SLC7A11 被下调[17]。

2.2.3 Nrf2

核因子E2相关因子2(Nrf2)在铁死亡中被证实起关键调控作用。Nrf2可以操控下游抗氧化基因(GPX4、血红加压素酶1等)，调节细胞死亡。

实验[13]将小鼠分成4组：正常组、白消安暴露组、白消安+Fer-1组、白消安+DFO组，观察到其 GPX4、Nrf2水平明显异常，经铁死亡抑制剂处理后恢复至正常水平，精子活力及精子浓度明显升高，对其形态学表现如小鼠附睾精子形态亦有改善作用。证实白消安通过下调Nrf2表达，从而导致GPX4表达下降，诱发铁死亡。

2.2.4 脂氧合酶催化多种不饱和脂肪酸

脂氧合酶催化多种不饱和脂肪酸(PUFAs)的氧化和降解，由于其在多种疾病中的作用而备受关注，如缺血性心肌病、糖尿病、慢性髓系白血病等都与脂质过氧化产物4(4HNE)的升高密切相关。4HNE来源于组织和细胞中ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)的脂质过氧化过程，其细胞毒性很大程度上依赖于其共价修饰，4HNE修饰会导致男性生殖细胞中蛋白稳态的严重变化，受精卵识别所需的关键蛋白急剧丢失[18]。

我们观察到在圆形精子细胞阶段是生殖细胞成熟的一个临界点，这个阶段细胞变得非常容易受到脂质过氧化、4HNE的产生以及相关4HNE修饰蛋白靶点(如热休克蛋白A2)相关不稳定性因素影响的关键点[19]，且对铁死亡具有独特的敏感性。在成熟的人类精子中，花生四烯酸-15-脂加氧酶(ALOX15)的抑制可阻止4HNE诱导的蛋白修饰也可改善精子功能和精卵相互作用。同时，在其他实验中运用RSL3等抑制剂观察GPX4等蛋白的变化，证实ALOX15可以诱导铁死亡[20]。

2.2.5 P53

P53在肿瘤发展、基因组完整性和正常细胞衰老过程中扮演重要角色。运用基因敲除小鼠实验发现[17]，p533KR/3KRXRCC4-/-表型小鼠出现衰老相关变化，男性生殖系统中的衰老主要表现在睾丸中观察到睾丸质量显著降低，广泛的生精上皮细胞变性。其途径描述为P53激活，致使SLC7A11表达下降，半胱氨酸摄取减少，GSH下降，同时伴随PTGS2(潜在铁死亡标志物)水平升高，致使铁死亡的发生，进而损伤睾丸。

2.2.6 其他因子

诸多其他因子也可以影响脂质过氧化的水平，如VDAC、CARS等，其中VDAC的研究与睾丸损伤联系最为密切。VDAC也称为线粒体孔蛋白，是在线粒体外膜中鉴定出的能够形成亲水孔结构的一组蛋白质。VDAC允许代谢物穿过线粒体外膜，并参与代谢物的运输和信号转导，其有三种同工型：VDAC1、VDAC2、VDAC3。VDAC的开放允许呼吸链底物、ADP、磷酸等进入线粒体。VDAC内含微管蛋白调节其开放，阻塞VDAC可以限制上述物质流入线粒体及ATP的产生，铁死亡可以抑制其阻塞作用，促进其开放，提高ADP/ATP的比值与氧化应激水平。运用荧光定位等技术发现：VDAC1主要位于Sertoli细胞中，VDAC2位于晚期精母细胞和精子细胞中，VDAC3位于睾丸所有细胞类型中，特别是在睾丸间质细胞中[21]。在亚砷酸盐处理的GC-2细胞诱发铁死亡中也观察到VDAC3表达含量的上升[10]。

2.3 MAPK

目前已有文献[12]报道证实MAPK信号路径可以诱发铁死亡，主要有以下3个蛋白即ERK、P38和JNK。在OGD/R睾丸支持细胞模型中对上述3种因子均进行通路分析发现，其不能促进JNK和ERK1/2的磷酸化，但NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)显著抑制了OGD/R诱导的P38 MAPK磷酸化，即其通过P38-MAPK路径触发铁死亡。