稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

薛 霜，徐 松，郑 成，徐丹丹，胡玉立，刘国兴，李婷婷，石宝兰，漆世华，谢红玲

(国药集团动物保健股份有限公司，武汉430075)

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起猪的一种急性、高度接触性、致死性的传染病。该病流行广泛，发病与死亡率高，一年四季猪不分年龄均可发生，给养猪业造成了严重经济损失。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约12.3 kb，由中间一个大的开放阅读框(open reading frame, ORF)和两端非编码区5’-UTR(untranslated region)及3’-UTR构成。ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，并在翻译过程中或翻译后被病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白水解酶加工切割成12种蛋白质[1-3]。其中E2蛋白是CSFV的主要结构蛋白，在CSFV中相对保守，是引起猪产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原，在猪瘟诊断和新型基因工程疫苗的研究上都起着重要作用[4-5]。

据报道，已有多种表达体系对CSFV E2蛋白进行了成功表达。其中原核表达系统具有表达周期快、表达量高、成本低等优势，但该系统不具有完善的蛋白翻译修饰功能，表达的E2蛋白与天然蛋白有差异，免疫原性较差，大部分只能用于抗体检测。CSFV E2蛋白的真核表达系统目前主要有酵母、杆状病毒及哺乳动物细胞表达系统。其中前两种表达系统主要优点为蛋白表达量高，但存在表达量不稳定的问题，而且所表达的目的蛋白加工修饰与蛋白本身的天然结构存在差异，如糖基化水平和糖链结构的差异导致所表达蛋白的免疫原性及功能活性受到影响。而哺乳动物细胞表达系统的翻译修饰体系是最为完善的，该系统表达的重组外源蛋白最接近天然构象。目前哺乳动物细胞表达系统大多为贴壁培养细胞，在培养过程中需要加入外源血清，不仅增加了生产成本而且对下游上清中目的蛋白的纯化造成影响。本研究选用可无血清悬浮培养的BHK-21细胞，并利用慢病毒包装系统，建立了能稳定表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系，为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BHK-21细胞、293T细胞、pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro质粒由国药集团动物保健股份有限公司实验室改造并保存；包装质粒pMD2.G、psPAX2购自北京擎科生物科技有限公司；Trans-stb13化学感受态细胞购自北京全式金生物公司。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA片段回收纯化试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒、CpoⅠ内切酶、NotⅠ内切酶、SolutionⅠ快速连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；嘌呤霉素购自北京索莱宝科技有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；CSFV E2单抗由国药集团动物保健股份有限公司实验室制备和保存；Ni-IDA亲和层析柱购自中科森辉微球技术(苏州)有限公司。

1.3 重组慢病毒表达载体的构建及慢病毒包装 参考猪瘟病毒(C株)基因序列，对E2蛋白核苷酸序列进行密码子优化，同时去除C端跨膜区的34个氨基酸，并在5’和3’端分别引入CpoⅠ和NotⅠ限制性酶切位点，在3’端引入6×His标签。优化后的CSFV E2基因由北京擎科生物科技有限公司合成。分别用CpoⅠ和NotⅠ限制性内切酶对慢病毒表达载体pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro和合成的截短E2基因进行双酶切，胶回收约1061 bp大小的目的片段和8720 bp大小的载体片段，用SolutionⅠ连接酶进行连接，连接产物转化Trans-stb13感受态细胞，之后挑取阳性菌提取质粒进行双酶切和测序鉴定，获得的阳性重组质粒命名为pCDH-E2。将构建的重组慢病毒表达质粒pCDH-E2与包装质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞进行慢病毒包装。

1.4 稳定表达E2蛋白的细胞株筛选

1.4.1 细胞感染 准备一块6孔细胞板，每孔接种1×105～4×105对数期生长的BHK-21贴壁细胞，分别设置空白孔、Control对照慢病毒孔和目的基因慢病毒孔，37 ℃培养过夜，当细胞密度在40%～60%时进行慢病毒感染；根据待感染细胞的 MOI值，分别往细胞中加入适量的Control对照慢病毒和目的慢病毒，混匀后，放入细胞培养箱中继续培养过夜。

1.4.2 稳定细胞株筛选 12～24 h后，给细胞更换正常的完全培养基，继续培养 48～72 h后加入终浓度为10 μg/mL的嘌呤霉素进行阳性细胞系的筛选。每2 d更换新的培养基(含10 μg/mL的嘌呤霉素)，直到培养皿中不再出现细胞死亡，同时观察绿色荧光。将药物筛选后的混合稳定克隆株消化后进行细胞计数，吸取100个细胞接种于10 mL培养基(含10 μg/mL的嘌呤霉素)中，吸打混合均匀后加入96孔细胞板中，100 μL/孔。3～5 d后，在显微镜下标出只含有单个细胞克隆的有绿色荧光的细胞孔进行传代扩增。扩增到合适的细胞量后，进行无血清悬浮培养及蛋白表达，将筛选后的稳定细胞株命名为BHK-LV-E2。

1.4.3 E2蛋白的表达及纯化 将传代至第10代悬浮培养状态较好(活力>90%)的BHK-LV-E2细胞株按0.6×106/mL初始细胞密度，置于37 ℃恒温摇床中进行蛋白表达，每天观察细胞状态并取样，将CSFV E2单抗以1∶500倍稀释作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体1∶1500倍稀释作为二抗，Western Blot分析E2蛋白的表达情况。收获第7天的表达样品，离心取上清进行Ni柱纯化，收集纯化过程各阶段样品进行SDS-PAGE检测分析。

2 结果与分析

2.1 重组慢病毒表达载体的鉴定 构建的重组慢病毒表达质粒pCDH-E2经CpoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定显示，可酶切出一条约1061 bp大小的目的片段和一条约8720 bp大小的载体片段(图1)，同时测序结果也显示合成的E2基因片段已正确插入表达载体中。

1：重组质粒pCDH-E2的CpoⅠ/NotⅠ双酶切产物；M：DNA分子量标准1: Enzyme digestion products of pCDH-E2 plasmid by CpoⅠ/NotⅠ; M: DNA Marker

2.2 稳定表达CSFV E2蛋白的细胞株筛选 表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后，获得重组慢病毒LV-E2。LV-E2感染BHK-21细胞后采用嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法挑取单细胞克隆进行稳定细胞株的筛选。结果显示，筛选后的细胞形态正常，由于pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro质粒携带绿色荧光蛋白基因EGFP，因此在倒置荧光显微镜下细胞显示绿色荧光(图2)。将筛选后获得的阳性克隆进行悬浮扩大培养，取第10代悬浮培养的阳性细胞克隆株进行蛋白表达稳定性鉴定，Western blot分析结果显示所构建的BHK-LV-E2细胞传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白(图3)。使用镍离子亲和层析柱对表达的E2蛋白进行纯化，结果显示当洗脱缓冲液中咪唑浓度为500 mmol/L时，可得到较为理想的纯化蛋白条带，且纯化后的蛋白纯度可达到90%以上(图4)。

图2 筛选后的阳性细胞荧光观察结果(100×)Fig 2 Fluorescence observation results of positive cells(100×)

1～7：分别为BHK-LV-E2细胞表达1～7 d样品；M：蛋白质分子量标准1～7: Samples of BHK-LV-E2 cells expressed for 1～7 days; M: Protein Marker

1：表达样品原液；2：流穿液；3～5：洗杂液；6～11：目的蛋白洗脱液；M：蛋白质分子量标准1: Original liquid of expression sample； 2: Flow through liquid；3～5: Wash liquid； 6～11: Purified E2 proteins; M: Protein Marker

3 讨论与结论

近年来各种病原变异新毒株层出不穷，猪场所使用的疫苗毒株也种类繁多，减毒疫苗和灭活疫苗混用，造成猪场的疫病防控现状非常复杂。特别是某些已经感染其他病原的猪场免疫减毒活疫苗的时候可能出现多种病原相互协同、相互促进的现象，反而造成猪场疫病的爆发。对于CSFV，传统的猪瘟减毒活疫苗C株的保护效果有目共睹，但是基于目前猪场复杂的防疫现状，更为安全的猪瘟灭活疫苗将能更好地满足目前的疫病防控需求。亚单位疫苗是病毒粒子的一部分，不含有核酸，具有安全性好、稳定性强和无需灭活的优点。E2蛋白是CSFV上最主要的抗原蛋白，能够诱导中和抗体的产生，具有良好的免疫原性，可制成标记性疫苗通过抗体检测区分疫苗免疫猪及野毒感染猪，用于猪场净化评估。因此E2蛋白是研制CSFV新型重组疫苗和抗体检出方法的重要候选抗原[6-7]。获得高纯度的E2蛋白是研制E2亚单位疫苗的重要基础。相对于原核表达系统而言，哺乳动物细胞具有翻译后加工与修饰表达蛋白的能力，表达出的蛋白更接近于病毒天然抗原蛋白结构，且通常可分泌于细胞上清中，有利于目的蛋白的纯化[8]。目前，构建稳定表达外源蛋白的细胞系的方法常用的有慢病毒感染与真核表达质粒的转染。相较于质粒转染目的细胞的方法，慢病毒表达系统具有构建周期短和高效的表达特性[9-10]。

CSFV E2蛋白属于跨膜蛋白，为使E2蛋白能够可溶性的表达于细胞上清中并利于蛋白的进一步纯化，本研究将编码E2蛋白跨膜区的基因删除后引入了His纯化标签。并且本研究使用的pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro质粒是经本实验室改造优化后的一种慢病毒载体质粒，可实现目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达，提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。因此，通过对绿色荧光的观察即可评估细胞的抗性筛选效果，并且可以使用流式细胞分选仪将绿色荧光强的细胞分选富集起来，这样大大加快了筛选高表达目的蛋白单克隆细胞的速度。此外，构建的重组慢病毒表达质粒pCDH-E2含有经真核细胞偏嗜性密码子优化的编码CSFV E2蛋白的基因，且在E2基因上游加入了信号肽促进E2蛋白的分泌表达。研究结果显示，经抗性筛选结合有限稀释法挑取单细胞克隆进行多轮筛选后，在荧光显微镜下观察，所有细胞都显示绿色荧光，表明成功筛选出阳性单克隆细胞。本研究选用了适合无血清悬浮培养的BHK-21细胞作为表达细胞，该细胞生长繁殖速度较快，特别适合大规模工业化生产，且表达的E2蛋白是分泌在细胞上清中的，均为加工成熟的蛋白，免疫原性更好。使用无血清的培养基进行悬浮培养，在能够大批量获得E2蛋白的同时可避免蛋白纯化时的血清干扰，从而提高蛋白纯度，节约生产成本。Western bolt检测第10代细胞的表达，结果显示E2基因已经整合到宿主细胞的基因组中。应用镍离子亲和层析柱对表达的E2重组蛋白进行了纯化，纯度可达90%以上。本研究成功构建了可稳定表达CSFV E2蛋白的BHK-LV-E2细胞系，该细胞系表达的E2抗原易于纯化，为深入探讨 CSFV E2蛋白的生物学特性和CSFV基因工程疫苗研制提供了物质基础。