高效液相色谱法测定复方非泼罗尼滴剂中抗氧剂的含量

姚路路，程婵婵，张 聪，魏 轲，杨会鲜，周德刚

(洛阳惠中兽药有限公司，河南洛阳 471000)

复方非泼罗尼滴剂的有效成分为非泼罗尼和甲氧普烯，非泼罗尼作用于跳蚤成虫和蜱，甲氧普烯作用于跳蚤卵和幼虫，二者连用发挥协同增效作用，可用于驱杀犬体表的成年跳蚤，跳蚤卵、幼虫和蜱，文献[1-4]报道，复方非泼罗尼滴剂可有效治疗和预防犬、猫蜱虫和跳蚤感染及室内环境中跳蚤清除，单次使用可提供长达30 d的保护。复方非泼罗尼滴剂中非泼罗尼易氧化，处方中添加叔丁基对羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)为抗氧剂，可有效抑制非泼罗尼的氧化降解，但复方非泼罗尼滴剂中抗氧剂的含量测定方法还缺少相关的检验标准，文献中对BHA、BHT的含量测定有很多报道[5-16]，但是，针对复方非泼罗尼滴剂中抗氧剂的含量检测未见有相关报道。由于本品为复方，且BHA、BHT的添加量比较低(分别为0.02%、0.01%，v/w)，采用文献方法检测干扰较大，为控制制剂质量，本研究拟建立高效液相色谱法(HPLC)测定复方非泼罗尼滴剂中BHA和BHT的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Alliance e2695型高效液相色谱仪(配有2998型PDA检测器和Empower 3工作站，美国Waters公司)；AB135-S型电子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.1.2 试药 二丁基羟基甲苯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：190065-201602，含量：99.9%)；叔丁基对羟基茴香醚对照品(Dr. Ehrenstorfer GmbH，批号：G129943，含量：99.4%)；复方非泼罗尼滴剂(洛阳惠中兽药有限公司，规格：1.34 mL/管，批号：20180401，20180402，20180403)；甲醇(Thermo Fisher公司，HPLC级)；乙腈(Thermo Fisher公司，HPLC级)；冰醋酸(天津市科密欧化学试剂开发中心，色谱纯)；水为超纯水。

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 × 4.6 mm，5 μm)；流动相A：乙腈-甲醇-水(47∶21∶32)，混合前在水中加入1%冰醋酸；流动相B：乙腈；采用线性梯度洗脱(0 min，100% A；7 min，100% A；7.1 min，40% A；20 min，40% A；20.1 min，15% A；25 min，15% A；25.1 min，100%A；30 min，100%A)，流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：285 nm；进样体积：20 μL。

1.2.2 溶液的制备 BHA对照品贮备液的制备：取BHA对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成0.1 mg/mL的溶液，摇匀，即得。BHT对照品贮备液的制备：取BHT对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成0.05 mg/mL的溶液，摇匀，即得。BHA、BHT对照品溶液的制备：精密量取BHA、BHT对照品贮备液各2 mL，分别置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。BHA和BHT混合对照品溶液的制备：精密量取BHA、BHT对照品储备液各2 mL，置同一20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。阴性样品溶液的制备：按复方非泼罗尼滴剂处方配制不加BHA、BHT的阴性样品，取约1.0 g，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取复方非泼罗尼滴剂约1.0 g，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 专属性 按1.2.1项下色谱条件，分别精密吸取空白溶剂、1.2.2项下BHA对照品溶液、BHT对照品溶液、BHA和BHT混合对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，对色谱图进行比对。

1.2.4 线性 分别精密吸取1.2.2项下BHA、BHT对照品贮备液1.0、2.0、2.0、3.0、3.0 mL，分别置同一20、25、20、25、20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到一系列浓度的BHA、BHT混合对照品溶液。分别精密吸取20 μL，从低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪，记录色谱图，以溶液浓度(C，mg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。

1.2.5 检测限与定量限 分别取1.2.2项下BHA、BHT对照品溶液，加甲醇逐步稀释后进样20 μL，以信噪比S/N=3的浓度作为检测限，以信噪比S/N=10的浓度作为定量限。

1.2.6 进样精密度 取1.2.2项下BHA和BHT混合对照品溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，重复进样6针，记录峰面积，计算其峰面积相对标准偏差(RSD)。

1.2.7 重复性 按照1.2.2项下方法制备供试品溶液，分别制备6份，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算BHA、BHT含量，计算RSD。

1.2.8 中间精密度 另一名分析人员在不同的日期使用不同的仪器独立建立系统，按照1.2.2项下方法重新制备6份供试品溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算BHA、BHT含量，计算RSD。

1.2.9 溶液稳定性 按照1.2.2项下方法制备BHA、BHT对照品溶液和供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，记录色谱图，计算其峰面积RSD。

1.2.10 加样回收率 取复方非泼罗尼滴剂(批号：20180401)0.5 g，精密称定，置20 mL量瓶中，平行9份，3个一组，分别精密加入BHA、BHT对照品储备液(BHA：0.05 mg/mL，BHT：0.025 mg/mL)1.0、2.0、3.0 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。

1.2.11 耐用性试验 取1.2.2项下对照品溶液和供试品溶液，通过改变柱温(25、30、35 ℃)、流动相比例(±1%)、流速(0.8、0.9、1.0 mL/min)以及使用同一品牌不同型号的色谱柱及不同品牌的色谱柱(Agilent Zorbax SB-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，序列号：USCL079103、USCL083984；Waters SunFire C18 序列号：01753614013846；Kromasil 100-5-C18 序列号：E168478)考察对BHA、BHT含量测定的影响。

1.2.12 样品测定 取本品三批，按1.2.2项下方法分别制备供试品溶液及对照品溶液，分别精密吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算样品中BHA、BHT的含量。

2 结果与分析

2.1 专属性 结果见图1，在该色谱条件下，空白溶剂中溶剂峰及阴性样品不干扰主峰含量测定。

A-空白溶剂 B-BHA、BHT混合对照品溶液 C-阴性样品溶液 D-供试品溶液A- Diluent B-Reference substance of BHA and BHT C- Negative control D- Test sample

2.2 线性 以溶液浓度(C，mg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。结果表明BHA在5.13～ 15.39 μg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程为y= 21755x+ 3853.5，相关系数为0.9996，BHT在2.56 ～ 7.66 μg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=8620.6x+2531，相关系数为0.9990。

2.3 检测限与定量限 以信噪比S/N=3的浓度作为检测限，测得BHA、BHT的检测限分别为0.08 μg/mL和0.19 μg/mL；以信噪比S/N=10的浓度作为定量限，测得BHA、BHT的定量限分别为0.31 μg/mL和0.77 μg/mL。

2.4 进样精密度 对进样精密度试验记录的色谱图进行处理，计算6次进样BHA、BHT保留时间的RSD分别为0.1%、0.1%，峰面积的RSD分别为0.3%、0.8%，表明进样精密度良好。

2.5 重复性 对重复性试验记录的色谱图进行处理，按外标法以峰面积计算BHA、BHT含量，6次测定结果BHA含量RSD为0.4%，BHT含量RSD为1.0%，表明方法重复性良好。

2.6 中间精密度 对中间精密度试验记录的色谱图进行处理，结果2人12次测定结果BHA含量RSD为0.6%，BHT含量RSD为1.4%，表明方法中间精密度良好。

2.7 溶液稳定性 对照品溶液放置24 h，BHA、BHT峰面积RSD分别为1.0%、0.7%，供试品溶液放置24 h，BHA、BHT峰面积RSD分别为0.5%、1.0%，表明对照品溶液及供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率 对加样回收率试验记录的色谱图进行处理，按外标法计算BHA、BHT含量，计算回收率，结果BHA平均回收率为98.5%，RSD为1.8%，BHT平均回收率为99.9%，RSD为2.8%，说明方法准确度良好，结果见表1～表2。

表1 BHA加样回收率试验结果(n=9)Tab 1 The result of sample recovery rate of BHA(n=9)

表2 BHT加样回收率试验结果(n=9)Tab 2 The result of sample recovery rate of BHT(n=9)

2.9 耐用性 试验结果见表3，结果表明，当方法中流速、柱温、流动相比例发生较小变化时，对BHA、BHT的含量测定影响均较小，不同批次色谱柱对BHA、BHT的含量影响较小，使用不同品牌色谱柱时，对BHT的含量影响较大，BHT峰与相邻杂质峰未达到基线分离，受杂质峰影响，导致其含量偏差较大，因此，规定本品采用Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱进行测定。

表3 耐用性试验结果Tab 3 The result of durability test

2.10 样品测定 按外标法计算三批样品中BHA、BHT的含量，测定结果见表4。

表4 复方非泼罗尼滴剂抗氧剂测定结果Tab 2 Determination Results of BHA and BHT inCompound Fipronil Spot-On Solutions

3 讨论与结论

3.1 检测波长的选择 采用PDA检测器，将BHA、BHT对照品溶液在190～400 nm范围内进行紫外扫描，Empower 3数据工作站分析，取每个峰的紫外吸收光谱图，记录每个峰的主要最大吸收波长，结果显示BHA最大吸收波长为290.3 nm，BHT最大吸收波长为277.2 nm，研究发现，波长设定为280 nm时，BHT峰左右两侧各有一杂质峰，多次调整色谱条件均不能实现基线分离，方法耐用性差，经分析发现BHT附近杂质最大吸收波长在266.5～277.2 nm，将检测波长设定为285 nm后，杂质干扰有明显改善，故将检测波长设定为285 nm。

3.2 色谱条件的建立 由于复方非泼罗尼滴剂中BHA、BHT的添加量比较低(分别为0.02%、0.01%，v/w)，为有效检出抗氧剂的含量，供试品溶液的配制浓度较高，非泼罗尼、甲氧普烯及杂质峰均有很强的响应，检测极易有干扰，本研究发现国内外仅有与BHA、BHT测定相关的文献[5-16]，且多为包材及植物油中的抗氧剂检测，仅有少数用于药品中的抗氧剂检测，未发现有复方非泼罗尼滴剂中BHA、BHT检测方法相关的文献，本试验尝试了文献中甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-甲酸-水系统、甲醇-乙酸-水系统、乙腈-乙酸-水系统、乙腈-乙酸铵-水系统等多种流动相系统，结果发现在以上这些色谱条件下，其他色谱峰对BHA、BHT峰均有严重干扰，后参照2011年进口再注册兽药“复方非泼罗尼滴剂(犬用)”质量标准中有关物质色谱条件乙腈-甲醇-1%醋酸溶液系统，结果发现BHA、BHT峰型相对较好，干扰较小，在此基础上对流动相比例、梯度洗脱程序进行不断的优化，同时比较了不同流速的影响，将流速调整为0.9 mL/min，分离效果相对较好，经过多次调整，最终采用1.2.1项下色谱条件BHA、BHT峰型较好，与相邻峰之间分离度良好，因此，最终确定1.2.1项下色谱条件作为抗氧剂检查用色谱条件。

采用文献所报道的方法均存在干扰，不适用于本品中抗氧剂的含量检测，本文所建立的复方非泼罗尼滴剂中的抗氧剂含量测定方法，在BHA、BHT相同保留时间处，阴性样品及空白稀释液均无色谱峰出现，BHA、BHT的检测限可达0.08 μg/mL和0.19 μg/mL；定量限可达0.31 μg/mL和0.77 μg/mL，说明所建立的方法专属性好、灵敏度高，加样回收率及耐用性结果表明所建立的方法准确度高、耐用性好，能准确检测出复方非泼罗尼滴剂中抗氧剂的含量。