硬骨鱼类Keap1-Nrf2/ARE 信号通路研究进展

周俊豪，刘念，杨映

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231）

早在1985 年就提出了氧化应激，即氧化还原生物学和医学中的一个概念[1]，它指机体遭受外界刺激时，细胞中呈现的氧化应激反应。在此过程中生物机体内的活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）是最为重要的指标之一。生物体内ROS 产生的量过高，自身抗氧化清除能力不足时，机体内脂质过氧化水平就会明显升高[2]，损伤氨基酸、线粒体、蛋白质、核酸和染色体，诱导多种细胞凋亡[3，4]，使得氧化－抗氧化系统失衡，使机体氧化损伤[5]。

诸多外界环境因素都可能对硬骨鱼类造成氧化应激并影响健康。例如，短期饥饿可导致翘嘴鳜Siniperca chuatsi 肠道氧化应激及细胞自噬[6]；长时间的运输会破坏斑马鱼Brachydanio rerio var 抗氧化平衡[7]；高密度养殖会导致团头鲂Megalobrama amblycephala 肠道氧化应激损伤，影响其正常生长[8]。水环境中重金属含量过多会引起大黄鱼Larimichthys crocea 氧化应激和免疫反应[9]、水体镉的暴露可导致黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco 组织损伤、氧化应激[10]；一些过度用药的畜禽代谢物排到水环境中也可能诱发成年斑马鱼的严重氧化应激和组织损伤[11]；饲料产品中常见的霉菌毒素可引起草鱼Ctenopharyngodon idella 的氧化损伤、细胞凋亡[12]；饲料中泽泻烯酮也可导致草鱼幼鱼氧化损伤、细胞凋亡[13]。

Keap1-Nrf2/ARE 是近年来研究发现的关键抗氧化应激通路，具有多个激活途径来维持细胞的氧化还原平衡及代谢，可调节生物体1%～10%的基因[14]。该通路可通过调控机体的下游靶蛋白（Ⅱ相代谢酶、抗氧化蛋白/酶、蛋白酶体、抗炎因子及Ⅲ相代谢酶等），诱导谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）、谷胱甘肽-S-转移酶（Gultathione S transferases，GST）、血红素加氧酶-1（Heme oxygenase 1，HO-1）、NADPH 醌氧化还原酶-1（NQO1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等保护性基因的表达，减轻机体氧化应激损伤。研究表明：鱼体内存在转录因子NF_E2 相因关子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2），且高度保守，在抗氧化应激反应中发挥重要作用。在正常生理状态下，Keap1 和Nrf2 结合而发生泛素化和蛋白酶体降解，使细胞核内Nrf2 的含量维持在相对较低水平。在氧化应激条件下，Keap1 对Nrf2 的作用机制主要有两种，一个是Keap1 中半胱氨酸残基的修饰，另一个是Keap1 和Nrf2 之间蛋白质-蛋白质相互作用的中断。泛素化和降解能力减弱，细核中Nrf2 积聚，Nrf2 与抗氧化反应元件ARE 结合后启动下游一系列保护性基因的表达，使机体从氧化应激状态恢复到正常的生理状态。Keap1-Nrf2/ARE 信号通路对硬骨鱼类的健康生长非常重要。

1 Keap1、Nrf2 和ARE 的分子基础

1.1 Keap1 的分子结构

Itoh 等[15]最早研究发现，Keap1 存在于从低等无脊椎动物到灵长类动物等多种物种中。Keap1 相对分子质量为6 900，是一个与胞浆肌动蛋白结合的编码624 个氨基酸的多肽，其包含5 个结构域[16]：N 端结构域（NTR）、干预区（IVR）、BTB 区、双甘氨酸重复区（DGR）和C 端结构域（CTR）[17,18]。IVR 区富含半胱氨酸残基，是Keap1 与氧化剂、亲电子性物质等发生反应的区域[19]，因此IVR 区在一定程度上决定着Nrf2 的稳定[17]。Keap1 二聚体化与BTB 区有关。该域内某些Ser 位点的突变可影响Keap1 二聚化，干扰Keap1 与Nrf2 的结合[20]。该区的核心位点是Ser-104，其发生突变将影响Keap1 的二聚化[14]；DGR 区含有6 个双甘氨酸重复序列是Keap1与Nrf2 的结合区。

与哺乳动物不同的是，在鱼类中发现了两种Keap1：Keap1a 和Keap1b。斑马鱼Keap1a 和Keap1b分别在288、273 位点有一个功能性半胱氨酸残基[21,22]。鱼类两种类型的Keap1（Keap1a 与Keap1b）在Keap1-Nrf2/ARE 通路中都显示了它们的功能[23]。这两者结构与功能的差异有待进一步研究。Nguyen等[24]分别敲除了斑马鱼Keap1a 和Keap1b 这两种基因，并用H2O2处理使两组斑马鱼氧化损伤，然后再使用萝卜硫素处理。结果发现，萝卜硫素仅能提高敲除Keap1a 斑马鱼组的存活率，Keap1b 比Keap1a 更能感知萝卜硫素。目前可以确定的是：两种Keap1 都可与Nrf2 结合并抑制Nrf2 的活性[25]，然而应答能力却有所区别[26]。胆碱能显著降低肌肉中Keap1a 和Keap1b 两者的mRNA 水平，提高Nrf2 水平[27]，膳食丁酸钠能提高肠道中Nrf2 的mRNA 水平时，只能降低肠道中Keap1b（而非Keap1a）的mRNA 水平[28]；黄曲霉素则是通过上调Keap1a（而不是Keap1b）来抑制Nrf2 信号，降低Nrf2 信号的水平和相关抗氧化酶的活性[29]。

1.2 Nrf2 的分子结构

Nrf2 是一种含亮氨酸拉链（Basic leucine zipper，b Zip）结构的转录因子，相对分子质量为66 000，属CNC（Cap-n-collar，CNC）调节蛋白家族。人类的Nrf2 基因有7 个功能结构域[30]，而在鱼类目前已报道的Nrf2 基因功能结构域是前6 个，依次命名为Neh1 到Neh6[15,31]。Neh1 结构域包含1 个碱性亮氨酸拉链结构，与sMaf 蛋白（small MAF proteins）发生相互作用[32,33]，促进DNA 与其形成异二聚体后识别并结合ARE，启动目标基因的转录。Neh1 结构域还参与调控Nrf2 的核转位和降解[34]；Neh2 域是与Keap1 的Kelch 区相结合的结构域，其在调节Nrf2活性中非常关键[15]；Neh3 域既具活化转录的功能，也能够影响蛋白质的稳定性[35]；Neh4 与Neh5 是两个转录激活域，都具有大量的酸性氨基酸残基。这两个结构域都能与转录激活因子CBP（CREB-binding protein）结合，促进下游靶基因转录[36,37]；Neh6 域具有大量丝氨酸残基，可在氧化应激时促进Nrf2 的降解，但具体机制有待进一步研究[38]。

1.3 ARE 基因序列

ARE 是一个特异的DNA－启动子结合区域。不同ARE 的碱基序列不同[39]，但越来越多的研究表明，具有典型功能活性ARE 的长度为16 个核苷酸序列，其中5 个核苷酸是可变的，因此基因组中ARE 具有多样性。

ARE 是重要的抗氧化反应元件。在正常状态时，ARE 的转录抑制因子Bach1（CNC 类似物）与小分子蛋白Maf 结合形成二聚体，防止Nrf2 与ARE结合；机体受到氧化应激后，Nrf2 解离进入胞核，与Maf 或Jun 蛋白、Fos 蛋白形成异二聚体，然后再与ARE 特异性结合，激活相应靶基因[40,41]。

2 Keap1-Nrf2/ARE 通路的激活机制

目前关于Nrf2 激活机制的研究已经取得了很大进展（图1）。Keap1 是一种直接与Nrf2 结合并负向调节Nrf2 转录活性的蛋白质[15]。Nrf2 活化后可与ARE 结合激活多种抗氧化基因，但Nrf2 的持续激活也会导致细胞组织氧化应激损伤[42]。Keap1 是泛素连接酶的衔接蛋白，Keap1 依靠E3 泛素连接酶促使Nrf2 以Keap1 依赖的方式泛素化，被蛋白酶体系统降解[43,44]，这使得Nrf2 蛋白水平在非应激条件下较低。Nrf2 激活化合物，攻击高活性半胱氨酸残基来抑制Keap1 的功能，并稳定Keap1-Nrf2 结合。因此在非应激条件下Nrf2 以Keap1-Nrf2 复合体的形式存在[45]。

Nrf2 的活化主要是Keap1 介导的泛素化对其降解作用减弱。Keap1 的Cys273 和Cys288 残基会抑制Nrf2 核积聚，但用亲电试剂可将半胱氨酸残基突变为丙氨酸，可使依赖于Keap1 的泛素化降低。位于BTB 区的Cys151 被氧化或共价修饰时，可使Keap1 对Nrf2 的抑制和泛素化减少[46]。除了Keap1依赖的降解，磷酸也可调节Nrf2 蛋白化。Nrf2 作为胰腺内质网激酶（Protein kinase RNAlike ER kinase，PERK）的底物，可被其直接磷酸化触发Nrf2-Keap1复合物的解离；磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PIK3）可通过重排丝状肌动蛋白的方式来改变Nrf2 的结构进而激活Nrf2；蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPKs）和细胞外信号调节激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）可以直接磷酸化Neh2 的Ser-40 来激活Nrf2[47]（图1）。

3 Keap1-Nrf2/ARE 信号通路在鱼类中的抗氧化功能

3.1 抗氧化作用

鱼类的生长与饲料营养成分的比例息息相关。如胆碱缺乏可引起肝脏和肠道的氧化损伤[48,49]，导致多种疾病。Pei 等[50]给建鲤Cyprinus curpiovar Jian幼鱼饲喂不同含量胆碱的饲料65 d，然后测定肝胰腺和肠组织的抗氧化酶活性及相关基因表达，发现膳食胆碱缺乏下调了肝胰腺中锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、血浆谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）以及Keap1b、GST 的mRNA 水平和肠道Nrf2 蛋白水平，同时上调了肝胰腺中GPx、Keap1a 和PKC 的mRNA 水平，证明胆碱缺乏引起的氧化损伤与肝细胞和小肠中抗氧化酶的Nrf2-Keap1 信号分子的转录变化有关。色氨酸是鱼类必需的氨基酸，对鱼类的生长具有重要意义[51]。Ke 等[52]用不同含量的色氨酸饲料饲养团头鲂，以了解色氨酸对机体抗氧化能力和免疫应答的影响使。结果表明，一定色氨酸含量的饲料可升高团头鲂体内SOD、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）和GSH 的活性，显著改善了团头鲂机体内Nrf2 水平，显著降低Keap1的mRNA 水平；Liang 等[53]则评估了精氨酸对团头鲂幼鱼肠道抗氧化状态和免疫功能的影响，发现精氨酸可有效提高GPX、铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）活性，T-AOC 活性和GSH 活性，显著提高总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和CAT 活性。精氨酸提高了团头鲂幼鱼Nrf2 的mRNA 水平，降低了Keap1 的mRNA 水平；Zhen 等[54]研究了在池塘滚道养殖系统（IPR）中放养密度对团头鲂引起的氧化应激，评估了高密度胁迫对团头鲂生长性能、抗氧化参数和Nrf2 的影响，发现高密度诱导了抗氧化防御涉及修饰Nrf2-Keap1 信号分子的酶和转录调控。

上述研究表明：无论是膳食营养或环境因素导致的硬骨鱼类抗氧化活性的增强或抑制，其途径都是通过调控Keap1-Nrf2/ARE 信号通路。因此，可认为以Keap1-Nrf2/ARE 信号通路介导II 相解毒酶和抗氧化基因的转录是细胞抗氧化机制中的关键通路。

3.2 抗炎症反应

HO-1 可抑制NF-κB（Nuclear Factor Kappa B）依赖的TNF-α 的生成，这种抗炎作用可能与Nrf2抑制NF-κB 活性有关。Jia 等[55]用H2O2作为活性氧诱导罗非鱼Oreochroms mossambcus 氧化应激造成肝损伤，评估潜在的分子机制。结果表明，72 h 内高水平的H2O2显著提高了GPT、GOT 和AKP 活性和丙二醛（MDA）含量，显著降低了SOD、GSH、CAT、GST 和T-AOC 活性。抑制了Nrf2/keap1 途径、HO-1、NQO1 和GST 等下游基因，通过上调NF-κB、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等mRNA 的表达而引起免疫毒性，激活炎症反应。这说明Nrf2/Keap1 和NF-κB信号通路在鱼类氧化应激性肝损伤中起重要作用；Jia 等[56]还研究了抗氧化药物白藜芦醇对罗非鱼氧化应激性肝损伤的保护作用及其机制。结果表明，白藜芦醇的调控机制主要是通过增强HO-1 等的mRNA 水平，激活了Nrf2 信号通路，抑制NF-κB 信号通路，降低IL-1β、TNF-α 等水平，从而降低H2O2所致肝损伤的炎症反应；Zhang 等[57]探讨了左旋肉碱在拉氏Rhynchocypris lagowskii Dybowski 体内外的作用，测定了Keap1、Nrf2、Maf 和HO-1 的mRNA 水平发现，左旋肉碱可以调控Nrf2/Keap1 通路的活化，抑制拉氏体内的NF-κB 信号通路来治疗由膳食氧化鱼油引起的拉氏炎症反应。这些结果说明：氧化应激与炎症有关，炎症过程可诱导氧化应激，氧化应激也可通过激活多种途径刺激炎症反应，其机制都与Keap1-Nrf2/ARE 信号通路密切相关，今后可以此为方向做进一步的研究。

4 硬骨鱼类Keap1-Nrf2/ARE 通路激活剂

Keap1-Nrf2/ARE 相关通路的激活剂可以有效地抑制由氧化应激诱导产生的一系列疾病。目前已开发出许多Nrf2 激活剂；一些天然及合成的小分子已被认定为ARE 系统的诱导剂，如上文提到过的胆碱、萝卜硫素等。Li 等[58]对二萜类化合物进行了quinone reductase（QR）分析，新发现了16 种二萜类化合物是Nrf2 介导防御反应的潜在激活剂，其中异海松烷类二萜类化合物（Spopelopsiin A，SA）被认为是最有效的二萜类Keap1-Nrf2/ARE 信号通路激活剂，效价约是萝卜硫素的5 倍。

除了一些化合物类激活剂外，中药低污染、低副作用等优点，植物中药有效成分对氧化应激作用的研究也越来越多。例如姜黄素是从植物姜黄中提取的黄色色素[59]。目前已证实，它可以通过修饰Keap1 上的半胱氨酸巯基，激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路[60]。已有研究表明：姜黄素可有效抑制有机磷农药毒死蜱（CPF）对鲤Cyprinus carpio 造成的氧化应激[61]；中药腺毛菊苣（Cichorium glandulosum Boiss.et Huet）具有抗氧化活性和保护肝脏的作用[62,63]。JMa 等[64]则研究了腺毛菊苣提取物菊苣酸（Cichoric acid CRA）是否可以通过抗氧化调节对斑马鱼幼鱼提供保护作用。其结果表明，CRA 激活了Keap1-Nfr2 和HO-1 通路，提高了斑马鱼体内SOD和GSH-Px 的活性；Yu 等[65]研究了一种胡芦巴种子提取物（Fenugreek seed extracts FSE）对团头鲂幼鱼的影响。结果表明，一定膳食比例的FSE 显著上调了Nrf2 的mRNA 水平，下调了Keap1 的mRNA 水平，促进幼龄团头鲂的Nrf2 抗氧化能力和免疫应答；大黄素来源于许多广泛使用的中药材[66]。Son等[67]研究证明，大黄素增强了血清免疫和抗氧化酶活性，通过Nrf2-Keap1 信号增强了团头鲂的抗氧化能力，大黄素可作为一种有效的免疫刺激剂，用于保护生物体由氧化脂质引起的氧化应激。植物提取物不仅低污染、低副作用，有些甚至成本很低，非常适用于一些硬骨鱼类的大规模养殖，今后可以此为方向进行Keap1-Nrf2/ ARE 信号通路激活剂的研究。

5 结语

Keap1-Nrf2/ARE 通路在抗氧化应激损伤中扮演着重要角色，但是有关鱼类Keap1-Nrf2/ARE 信号通路的报道并不多见。有关鱼类Keap1-Nrf2/ARE通路与其他信号通路之间交互作用、鱼类和陆生动物Keap1-Nrf2 之间差异的研究更是少见。与陆生动物不同，硬骨鱼类的Keap1 分为Keap1a 和Keap1b两种，但具体的功能与作用机制还尚未定论，今后可以此为切入点进行更深一步的相关研究。目前在水产养殖中已发现越来越多具有抗氧化活性的天然植物提取物可调控Keap1-Nrf2/ARE 通路以预防或有效解决硬骨鱼类的氧化应激问题，这为解决水产养殖业中出现的氧化应激和炎症问题提供了新的思路。