半滑舌鳎黏蛋白样蛋白基因克隆及其组织分布和时序表达

金歌，费金鹏，胡秀彩，谭静，吕爱军，孙敬锋

（天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）肉质鲜美、出肉率高、营养丰富，受到广大消费者的青睐[1]，是我国主要分布于渤海、黄海和东海海域特有的名贵经济海水鱼类之一。近年来，我国半滑舌鳎多采用集约化养殖，但由于饲养密度过大、水质环境差，多种细菌性传染病频繁发生造成了巨大的经济损失[2,3]。

鱼类生活在比陆地更为复杂的水生环境中，更易接触病原体，包括细菌、病毒、寄生虫等[4,5]。鱼类皮肤黏液主要由黏蛋白、免疫球蛋白和酶类等组成[6]。黏蛋白作为黏液的主要成分，在鱼类抵制病原菌入侵中发挥重要作用。鱼类黏蛋白主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两大类[7,8]。近年来，已陆续在斑马鱼（Danio rerio）[9,10]、鲤（Cyprinus carpio）[11]、金头鲷（Sparus aurata）[12]、海鳟（Salmo trutta）[13]以及半滑舌鳎[14,15]等硬骨鱼类中，发现有MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC13 和MUC18 等黏蛋白。在脊椎动物中还发现一些黏蛋白样蛋白（Mucin-like protein,MLP）基因[10,16]，与人类MUC2黏蛋白由同一基因编码[17]。但是，关于半滑舌鳎黏蛋白MLP 基因克隆表达及功能研究，目前尚未见报道。

本研究采用RT-PCR 方法扩增和克隆了半滑舌鳎黏蛋白CsMLP 基因，利用生物信息学方法预测分析了基因蛋白结构，分析CsMLP 在各组织分布和创伤弧菌感染后其在皮肤中的表达模式，以期为深入研究黏蛋白在鱼类免疫过程中的功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

致病性创伤弧菌ST-6 菌株由本试验室从发病半滑舌鳎分离纯化并保存[2]。半滑舌鳎购自天津某养殖公司，平均体质量（110±10）g，体长为25～30 cm，置于1.2 m×0.8 m×0.6 m 的网箱中室内暂养2周，每天投喂普通饲料2 次、换水1 次，水温维持在（25±2）℃，盐度12。确认健康活泼无病后用于后续实验。

实验用Trizol 试剂、焦碳酸二乙酯DEPC、Prime Script RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RHaseH Plus）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；主要检测仪器有：CFX96 型荧光定量PCR 仪（BIO-RAD）、NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo）、琼脂糖水平电泳仪（北京市六一仪器厂，DYCP-31BN）、和台式高速冷冻离心机（Legend Mach 1.6R，赛默飞世尔仪器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人工感染半滑舌鳎及组织样品收集

创伤弧菌感染半滑舌鳎实验，参照胡秀彩等[2]方法进行。取保存于-80℃的创伤弧菌ST-6 菌株，无菌接种于2216E 培养基中，28℃、120 r/min 过夜培养。菌液浓度用比浊法调至1×106CFU/mL 后，给半滑舌鳎腹腔注射，剂量为100 μL。对照组注射等量0.85%的生理盐水。无菌操作取其皮肤、鳃、肝、脾和肠道；注射6 h、12 h、24 h 和36 h 时皮肤取样，用生理盐水冲洗以去除黏液，置于液氮中冷冻保存备用。

1.2.2 组织总RNA 提取与cDNA 第一链合成

参照谭静等[14]的方法，用TRIzol Reagent 抽提RNA，-80℃冰箱保存备用。用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量，用Nanodrop ND-2000 分光光度计测定其浓度及OD260/OD280。然后以提取的总RNA 为模板，用TaKaRa 反转录试剂盒（PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成第一链cDNA，合成的cDNA 于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 引物设计及半滑舌鳎CsMLP 基因克隆

参考半滑舌鳎基因组黏蛋白MLP 基因序列（登录号：XM_025055452）设计2 对黏蛋白特异性引物用于RT-PCR 扩增和1 对引物用于qPCR 扩增（表1），引物由金唯智生物科技有限公司合成。

表1 半滑舌鳎黏蛋白MLP 基因引物序列Tab.1 Primer sequence of MLP gene in semi-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis

以半滑舌鳎皮肤组织cDNA 为模板，采用RT-PCR 方法扩增CsMLP。PCR 扩增体系为25 μL，包括cDNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL、Master Mix 10 μL 和ddH2O 11 μL。PCR 反应条件为：95℃预变性2 min；95℃40 s，55℃45 s，72℃1 min 30 s，30 个循环；72℃延伸5 min。PCR 产物用1%琼脂糖检测后，用DNA 胶回收试剂盒回收目的基因片段；胶回收产物与pMD18-T 载体进行连接，进一步转化到DH5α 感受态细胞中，挑取阳性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.4 CsMLP 蛋白序列与结构预测

利用ExPASy ProtParam tool 分析该蛋白质的理化性质、NetOGlyc 4.0 Server 和NetPhos 3.1 Server 预测其糖基化与其磷酸化位点、SMART 预测蛋白质结构域；利用DNAStar 中Protean 软件分析该蛋白的疏水性、表面可能性、抗原指数及综合预测其抗原表位；利用PSIPRED 在线分析其二级结构、Phyre2进行蛋白三级结构预测，ClustalW 及MEGA 6.0 进行序列比对。

1.2.5 实时荧光定量PCR

以cDNA 为qPCR 模板，GAPDH 为内参基因（引物序列见表1），利用CFX96 型荧光定量PCR 仪进行不同组织和创伤弧菌感染后其在皮肤各个时间点的定量分析，每个组织及时间点各取3 个样品，每个样品重复3 次。20 μL 反应体系包括SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上下游引物（10 μM）各0.5 μL，各组织cDNA 模板2 μL，ddH2O 7 μL。反应程序为：95℃3 min；95℃15 s，60℃1 min，40 个循环；72℃2 min；65℃5 s；95℃5 s。通过制作标准曲线来检测实时荧光定量PCR 引物的特异性和试验的可靠性。绘制标准曲线以皮肤组织的cDNA 为模板，进行4 倍倍比稀释，取5 个稀释梯度进行反应，每个梯度设3 个平行，并做不加模板对照，确定每个基因扩增后标准曲线的扩增效率（E）在90%～105%之间，R2>0.990；产生的溶解曲线是单一波峰后为有效数据，每个样品进行3 次重复试验，分别制作目的基因CsMLP 和内参基因GAPDH 的标准曲线（扩增效率为E=95%，相关系数R2=0.997）。根据扩增得到Ct 值，通过2-ΔΔCt法计算MLP 基因的相对表达量，采用SPSS 19.0 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 半滑舌鳎CsMLP 蛋白理化特性分析

采用RT-PCR 方法扩增半滑舌鳎皮肤黏蛋白CsMLP 基因片段，分别获得特异性片段长度大小为1 500 bp 和1 400 bp 左右目的条带，与预期片段大小一致（图1），测序获得长度为1 506 bp 和1 589 bp的两条序列，经拼接基因全长为2 989 bp，推测可编码996 氨基酸（aa），与半滑舌鳎基因组黏蛋白MLP基因序列（XM_025055452）相似性为91.31%。预测分子量为104.30 kDa，理论等电点（pI）为4.47、蛋白不稳定系数为47.99、亲水性平均系数（GRAVY）为-0.558，表明半滑舌鳎蛋白CsMLP 属于亲水蛋白。DNAstar 软件预测CsMLP 可形成抗原表位的氨基酸区域数有6 个，分别是43～49、175～195、406～426、455～465、559～587 和990～996 aa（图2）。对CsMLP蛋白修饰位点的预测结果表明：CsMLP 有5 个糖基化位点（Thr568、Ser571、Ser767、Ser782、Thr844）和24 个磷酸化位点（阈值≥0.9），其中16 个为丝氨酸（Ser）磷酸化位点（S27/30/77/239/498/571/591/600/634/647/681/694/728/741/754/991）、4 个苏氨酸（Thr）磷酸化位点（T9/70/76/581）及4 个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点（Y41/500/778/809）。

2.2 黏蛋白基因序列比对及3D 结构预测

通过Blast 同源性检索分析结果发现，半滑舌鳎CsMLP 与黄金鲈（Perca flavescens，XP_028432905）MLP 同源性最高为56.18%，其次与大西洋鳙鲽（Hippoglossus hippoglossus，XP_034437605.1）为50.78%，与石斑鱼（Epinephelus lanceolatus，XP_033488230.1）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes，XP_029701618.1）和斑马鱼（Danio rerio，XP_002667589）分别为44.07%、39.34%和33.15%；但与非洲爪蟾（Xenopus laevis，XP_018113014）、人（Homo sapiens，CAA04737.1）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus，XP_0308517 49.1）等同源性较低，分别为26.91%、22.63%和15.69%（表2）。CsMLP 蛋白结构域分析显示（图3），CsMLP 蛋白共含有3 个结构域，分别为VWD（smart00216,98～273 aa）、C8（pfam08742,318～379 aa）和CK（smart00041,908～982 aa）。二级结构预测结果表明，该蛋白以β-折叠为主，其中C8 区主要由α-螺旋构成，VWD、CK 区主要由β 折叠构成。三级结构与二级结构预测结果基本一致（图4）。

表2 CsMLP 序列同源性比对分析Tab.2 Homology analysis of sequence alignment of CsMLP gene

2.3 CsMLP 基因的组织分布及创伤弧菌感染后皮肤表达分析

用SYBR Green Ⅱ实时荧光定量PCR 法分析了CsMLP 基因mRNA 的组织分布、创伤弧菌感染后CsMLP 皮肤表达模式。结果显示：CsMLP 基因扩增效率为E=103.2%，相关系数R2=0.994，对应的熔解曲线生成单一峰、无引物二聚体和非特异性产物，表明引物具有特异性，可用于相对定量qPCR 检测分析。CsMLP 基因广泛存在多个组织中，但存在一定组织差异性，其中鳃、皮肤中表达量较高，而在脾脏、肝脏和肠道中表达水平较低（图5-A）。创伤弧菌感染半滑舌鳎后，皮肤组织中CsMLP 基因在短时间内显著下调表达，刺激12 h 后表达显著增加（P<0.05），达最高峰表达量，约为对照组的2.5 倍，感染36 h 后显著性下调表达（P<0.01）（图5-B）。

3 讨论

近年来，重要养殖经济鱼类半滑舌鳎多种细菌性传染病频繁发生，其中弧菌感染危害严重[2,3]。皮肤及其黏液是鱼体抵抗病原体的重要防线，其中黏蛋白为黏液的主要成分[14,15,18]。黏蛋白是一类富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸高度串联重复结构域的大分子类糖蛋白，根据蛋白特性可分为两大类即膜结合型黏蛋白和分泌型黏蛋白[7,8]。分泌型黏蛋白进一步可分为大分子的凝胶形成型黏蛋白（SGFM）和小分子的可溶性黏蛋白[19]。SGFM 含有一个血管性血友病因子D 型结构域（VWD），富含半胱氨酸的C8 结构域（C8）和C 末端半胱氨酸结（CK），参与黏蛋白的低聚反应[13]。本研究采用RT-PCR 方法克隆获得半滑舌鳎分泌型黏蛋白CsMLP，预测含有三个保守结构域（即VWD、C8 和CK），与金头鲷中的MUC2保守结构域一致[10]。系统发育进化树结果显示，半滑舌鳎CsMLP 与MUC2 同属于分泌型黏蛋白家族。同源性分析表明，CsMLP 氨基酸序列与黄金鲈、大西洋鳙鲽、斑马鱼等鱼类序列同源性较高，但与非洲爪蟾、人、鼠、海胆等同源性较低，值得进一步探索其生物学功能。

黏蛋白不仅参与细菌黏附侵入过程，且与宿主细胞增殖分化、细胞凋亡免疫和信号转导等多种生物学过程有关[10,20]。近年来，关于鱼类黏蛋白的表达及功能研究也逐渐成为关注热点，主要集中在膜结合型和分泌型黏蛋白MUC2、MUC5AC 和MUC18等[14,15]。但是，关于半滑舌鳎黏蛋白样蛋白CsMLP基因克隆表达研究，目前尚未见报道。薛春雨等[8]克隆获得了团头鲂（Megalobrama amblycephala）MUC5B 基因，发现其在皮肤和鳃中表达量最高。Pérez-Sánchez 等[12]研究了李氏粘体虫（Enteromyxum leei）感染金头鲷后MUC13、MUC18 等黏蛋白的组织分布及肠道表达时序。Sveen 等[16]分析了大西洋鲑（Salmo salar）全基因组，获得MUC2 和MUC5基因序列，发现MUC2 基因主要在肠道表达，而MUC5 基因主要在皮肤和鳃中表达。在鲤（Cyprinus carpio）中黏蛋白MUC2、MUC5B 的组织分布与鲑的研究中也报道类似结果[9]。CyHV-3 感染鲤后MUC5B 基因下调表达[21]。Marcos-López 等[22]研究发现，大西洋鲑感染阿米巴鳃病后，分泌型黏蛋白MUC5AC 表达量显著增加，膜结合型黏蛋白MUC18却下调表达明显。本研究发现半滑舌鳎CsMLP 基因主要在皮肤和鳃中大量表达，这与鲤MUC5B、大西洋鲑MUC5AC 基因组织表达模式类似[9,22]。多数黏蛋白的分布均呈组织特异性，如人类的MUC2 主要在肠道特异性表达[23]。本实验采用创伤弧菌感染半滑舌鳎后CsMLP 基因在短时间内显著下调表达，随后在刺激12 h 后表达显著增加，36 h 后显著性下调表达，结果表明CsMLP 在细菌感染半滑舌鳎抗病应答过程中发挥重要作用。本实验主要分析了创伤弧菌感染半滑舌鳎后MLP[24]基因在皮肤组织中的表达，关于在脾脏、肝脏和肠道组织的表达模式有待进一步研究。

本研究克隆了半滑舌鳎皮肤黏蛋白CsMLP 基因序列，进行了生物信息学分析，采用荧光定量分析其在各组织中分布情况和创伤弧菌感染后在皮肤中的表达模式，不仅为研究鱼类黏蛋白基因功能奠定基础，而且对鱼类疾病免疫预防研究具有重要意义。