Beclin-1、苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1在非小细胞肺癌中的表达及对预后的影响

杨昕，刘芳，张继朋，张顺

陕西中医药大学第二附属医院1病理科，3心胸外科，陕西 咸阳 712000 2空军军医大学唐都医院胸外科，西安 710038

肺癌的病死率在过去30年上升尤为明显，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%[1-2]。该病已成为严重危害人类健康的重大疾病，寻求新的NSCLC诊疗手段是亟待解决的难题。近年来，分子生物学飞速发展，使得临床提高了对NSCLC的分子特征认知。了解肿瘤相关蛋白的变化，对指导临床评估NSCLC预后有重要意义。已有多项研究报道，Beclin-1介导肿瘤细胞自噬，与肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的病情进展密切相关[3-4]。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1（budding unin-hibited by benzimidazoles 1，BUB1）可调控肿瘤细胞生物学行为[5]。目前，BUB1与NSCLC患者病情进展、预后关系的研究较少。本研究探讨Beclin-1、BUB1在NSCLC中的表达及对预后的影响，以期为临床诊治NSCLC提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2020年1月陕西中医药大学第二附属医院收治的NSCLC患者的病历资料。纳入标准：①经纤维支气管镜/经皮肺穿刺组织活检病理或细针穿刺、痰细胞学确诊为NSCLC[6]；②既往未接受过化疗或其他抗肿瘤药物治疗；③除肿瘤原发疾病外，无其他明显威胁生存的疾病，如严重肺功能不全、心功能不全、肝功能或肾功能不全、严重贫血等。排除标准：①合并第二原发恶性肿瘤；②小细胞肺癌；③精神障碍。根据纳入、排除标准，共纳入109例NSCLC患者，其中，男68例，女41例；年龄55～83岁，平均（60.11±5.36）岁；病程0.95～3.17年，平均（1.45±0.47）年。选取 109例NSCLC患者的肿瘤组织及癌旁正常组织（距肿瘤5 cm以上）。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 Beclin-1、BUB1蛋白检测方法

采用免疫组化法检测Beclin-1、BUB1蛋白表达情况。蜡块经连续切片（厚度4 μm）后，进行免疫组化染色。均经甲醛溶液固定，石蜡包埋，载玻片泡酸，高温灭菌，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤，多聚赖氨酸涂片。显色液的配用：取一无菌试管加入0.85 ml蒸馏水，根据二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂盒要求，按显色剂A、B、C次序各取5µl加入无菌试管中，充分振荡，配制成l ml的DAB显色液。室温下染色时间为3～5 min。后将经DAB显色液显色的肿瘤组织及癌旁正常组织标本使用苏木精复染、脱水、树胶封固。最后在显微镜下观察Beclin-1、BUB1蛋白表达情况。

1.3 阳性判断标准

光学显微镜下观察Beclin-1及BUB1蛋白染色情况。根据细胞核着色情况判定阳性及阴性，由两位病理科医师独立评分。阳性细胞比例评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度评分：未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色指数=阳性细胞比例评分+染色强度评分。染色指数＞3分为阳性表达，染色指数≤3分为阴性表达[7]。

1.4 观察指标

比较不同组织中Beclin-1及BUB1蛋白阳性表达率，分析二者与NSCLC患者临床特征及预后的关系。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin-1及BUB1蛋白表达情况的比较

肿瘤组织中Beclin-1阳性表达率明显低于癌旁正常组织，BUB1阳性表达率明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 NSCLC肿瘤组织及癌旁正常组织中Beclin-1及BUB1蛋白表达情况的比较[n（%）]

2.2 Beclin-1及BUB1与NSCLC患者临床特征的关系

不同性别、年龄、肿瘤直径、组织学类型NSCLC患者的NSCLC组织中Beclin-1及BUB1阳性表达率比较，差异均无统计学意义与（P＞0.05）；不同分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况NSCLC患者的NSCLC组织中Beclin-1及BUB1阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征NSCLC患者的NSCLC组织中Beclin-1及BUB1表达情况的比较

2.3 不同预后NSCLC患者Beclin-1及BUB1表达情况的比较

2年后，109例NSCLC患者生存61例（55.96%），死亡48例（44.04%）。死亡患者Beclin-1阳性表达率低于生存患者，BUB1阳性表达率高于生存患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同预后NSCLC患者Beclin-1及BUB1表达情况的比较[n（%）]

3 讨论

肺癌在男性肿瘤相关性死亡原因中居首位，在女性肿瘤相关性死亡原因中居第二位，目前已成为世界范围内肿瘤相关性死亡的主要原因之一[8]。研究显示，随着诊疗及治疗技术的提升，NSCLC患者生存率得到一定提升，但仍不理想[9-10]。

Beclin-1是程序性死亡细胞通路的相关因子，可通过细胞环境的刺激启动、抑制细胞凋亡的过程，在恶性肿瘤中发挥关键作用[11]。BUB1是在细胞间期时合成的一种蛋白，首先在某些细胞的分裂前期的着丝点上被发现，与细胞分化及衰老相关[12]。本研究通过免疫组化法检测Beclin-1、BUB1表达情况发现，肿瘤组织中Beclin-1阳性表达率明显低于癌旁正常组织，BUB1阳性表达率明显高于癌旁正常组织，可见Beclin-1、BUB1蛋白的调控在NSCLC发生发展的起始阶段发挥重要作用。

既往文献报道，肿瘤细胞可以通过凋亡被消灭，而Beclin-1在细胞发生凋亡时受到抑制，在肿瘤细胞被激活的情况下，Beclin-1可具有保护肿瘤细胞免受凋亡的作用，成为保护性蛋白[13-14]。目前，关于BUB1与NSCLC发生、发展及预后的关系鲜有报道，但已有研究证实，其与前列腺癌和妇科恶性肿瘤存在联系，认为BUB1通过多种分子生物学机制参与调控肿瘤细胞的生物学过程[15]。BUB1阳性表达率升高可能会导致有丝分裂检查点功能异常，细胞控制有丝分裂进程的机制失效，使得染色体异常分离形成非整倍体，引起细胞异常增殖，最终推动细胞的恶化进程，促进肿瘤的发生和发展。本研究发现，Beclin-1、BUB1表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关。随访2年，109例NSCLC患者中，生存61例（55.96%），死亡48例（44.04%）；死亡患者Beclin-1阳性表达率低于生存患者，BUB1阳性表达率高于生存患者，提示Beclin-1、BUB1与NSCLC患者病情进展、预后密切相关，进一步证实上述观点。Beclin-1、BUB1表达可用于NSCLC患者的预后评估，二者与NSCLC临床特征有关，皆可作为诊断早期NSCLC的标志物，提高NSCLC的早期诊断率，是NSCLC早期诊断和靶向治疗的新方向。但本研究存在一定的局限性，Beclin-1、BUB1具体是怎样影响NSCLC细胞的功能，需进一步研究加以阐述。

综上所述，Beclin-1、BUB1参与NSCLC的发生、发展过程，且Beclin-1阴性表达、BUB1阳性表达会增加NSCLC患者预后死亡的风险，二者对NSCLC的发生及发展可能起到一定的调控作用。