桑葚蓝莓复合饮料的研制及其抗氧化活性研究

王大全，夏丹丹，纵凯莉，孙永鑫，杨剑婷

(安徽科技学院 食品工程学院，安徽 滁州 233100)

桑葚又名桑果、桑枣，作为一种很古老的水果和中药[1]，已经被国家列为“药食同源产品”[2]。桑葚中除了含有有机酸、维生素、氨基酸等多种营养物质外[3-4]，还含有花色苷和酚类等多种功能成分[5]。研究显示，桑葚能有效地清除自由基[6]，具有抗肿瘤[7]、降血糖[8]、降低脂肪[9]等多种功效。蓝莓又称“越橘”，其果实中富含花色苷、黄酮、多酚等多种活性成分，具有延缓衰老、预防心血管疾病、降血脂等多种对人体非常有益的功能[10]。桑葚和蓝莓由于不易储藏，少部分用于鲜食，主要用于生产加工，例如果酒、果酱、果醋等制品。但是由于桑葚和蓝莓中果胶含量丰富，在果实破碎制汁的加工中影响花青素从细胞中的溶出[11]，因此常用果胶酶、纤维素酶以及复合酶使得花色苷便于从细胞中溶出。研究发现果胶酶不仅可以提高杨梅花色苷的提取量，而且不影响花色苷的抗氧化活性[12]。蓝莓和桑葚含有丰富的花色苷，其结构中的酚羟基在植物组织中具有保护易氧化成分的作用，具有很强的抗氧化活性[13]，利用这一特性，开发出一款具有抗氧化活性的桑葚蓝莓复合饮料。

本研究以桑葚、蓝莓为原材料制备桑葚蓝莓复合饮料，利用复合果胶酶对桑葚、蓝莓原汁进行前处理，提高花色苷溶出量，确定最佳酶添加量、酶解时间、酶解温度，在此基础上添加一定量的柠檬酸、蔗糖，通过复配制备桑葚蓝莓复合饮料，并以DPPH、ABTS自由基清除率、总还原力为指标与相同质量浓度的维生素C相比较，对该功能性复合饮料的抗氧化活性进行研究，旨在为富含花色苷功能性饮品的开发提供理论依据和方法基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓，安徽省凤阳县健民蓝莓农业发展有限公司；桑葚，亳州鑫地生态农业有限公司；复合果胶酶(酶活力100000 U/g)，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸，合肥盛润生物制品有限公司；蔗糖，合肥徽宣食品有限公司；盐酸、氯化钾、六水合三氯化铁、六氰合铁(Ⅲ)酸钾(铁氰化钾)、三氯化铁、三氯乙酸、无水乙醇(95%)、2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐(2,2’-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid Ammonium Salt)ABTS)，国药集团化学试剂有限公司；1,1-联苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical DPPH)，北京百奥莱博科技有限公司，以上化学试剂皆为分析纯。

1.2 仪器与设备

pH计(PHS-3C)，上海仪电科学仪器股份有限公司；分析天平(JA303P)，常州市幸运电子设备有限公司；紫外分光光度计(SP-752)，上海光谱仪器有限公司；均质机(D-500Pro)，上海沪析实业有限公司；离心机(RJ-TDL-50A)，无锡市瑞江分析仪器有限公司。

1.3 桑葚蓝莓复合饮料的制备方法

选择无机械损伤和腐烂的桑葚、蓝莓，去除果梗，置于破壁机处理3 min，得到桑葚果浆和蓝莓果浆，加入适量复合果胶酶，在一定温度下处理一段时间，200目滤布过滤取滤液即为桑葚、蓝莓原汁，避光冷藏备用。将处理好的桑葚、蓝莓原汁按一定比例混合均匀，添加适宜含量的柠檬酸、蔗糖进行调配。用玻璃瓶进行灌装后，采用高温瞬时杀菌法(121 ℃，10 s)对复合饮料进行灭菌[14]。

1.4 复合果胶酶酶解最佳条件的确定

以花色苷溶出量为指标，选取酶添加量、酶解温度、酶解时间三个因素，确定最佳酶解条件。因素水平见表1。

表1 复合果胶酶酶解试验因素水平表

1.5 复合饮料最佳配方的确定

将桑葚原汁和蓝莓原汁及柠檬酸、蔗糖进行调配(以100 mL为标准)，以感官评分为指标确定最佳配方，因素水平见表2。

表2 复合饮料配比实验因素水平表

1.6 正交试验设计

表3 正交实验因素水平设计

1.7 感官评价

桑葚蓝莓复合饮料的配方评价采用感官综合评分法，参照GB7101-2015食品安全国家标准饮料进行评价[15]，制定出评价标准，如表4所示。邀请具备饮料感官评价能力的10名感官评价者，根据饮料的色泽、口感、气味与质地进行评分。

表4 桑葚蓝莓复合饮料的感官评分标准

1.8 桑葚、蓝莓原汁和复合饮料中花色苷测定

采取pH示差法[16]测定。精确量取1 mL原汁或饮料于25 mL试管中，分别用pH值为1.0和4.5的缓冲溶液定容，低温(4 ℃)静置120 min，测定其在520 nm和700 nm处的吸光度值，按公式(1)计算花色苷含量。

(1)

公式(1)中，A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5；M：Cy-3-Glu(矢车菊色素-3-葡萄糖苷)的相对分子量(449.2)；Df：稀释倍数；ε：Cy-3-Glu的摩尔消光系数(26900)；L：光程长度(1 cm)。

1.9 桑葚蓝莓复合饮料抗氧化活性测定

将制备好的复合饮料根据其花色苷含量，将其质量浓度调整为20、40、60、80、100 μg/mL，分别测定其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力，并与相同浓度下的维生素C进行比较。

DPPH自由基清除率的测定：取稀释后不同浓度的复合饮料2.0 mL与0.1 mmol/LDPPH乙醇溶液2.0 mL充分反应30 min，在517 nm波长处测定其吸光值A1；将复合饮料和DPPH乙醇溶液用无水乙醇进行替换，按照上述方法，分别测定其吸光值A0、A2。采用相对应浓度的维生素C作为复合饮料的对照，重复测定3次。DPPH自由基清除率按公式(2)计算[17]。

(2)

公式(2)中，A1：复合饮料的吸光度；A2：无水乙醇取代复合饮料的吸光度；A0：无水乙醇取代DPPH乙醇溶液的吸光度。

ABTS自由基清除率的测定：取7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和140 mmol/L的过硫酸钾溶液0.440 mL混合均匀，存放于室温、避光条件下12-16 h。用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释混合后的溶液至其在734 nm处的吸光值为(0.70±0.02)。准确吸取1 mL不同质量浓度的复合饮料样液加入到4 mL ABTS溶液中，在30 ℃水浴中反应6 min。以去离子水为参比溶液，以相同浓度的维生素C溶液作为对照，在734 nm波长处测定吸光值，每组分别设置3个平行，根据公式(3)计算ABTS自由基清除率[18]。

调查发现，大部分医护工作者认为医护职业风险大、责任重，在日常诊治、护理中经常会面临一些突发状况。因此，应关注医护工作者生存状态，制定相关政策法规，维护医护工作者的合法权益。同时，借助大众传媒在公众心目中树立良好的医护工作者职业形象，突出其在社会发展中的重要作用和无私奉献精神，提高公众对医护工作者的尊重和信任，以增强医护工作者的职业认同程度。

公式(3)中，A1：加入复合饮料后的吸光度；A2：用去离子水代替ABTS溶液的吸光度；A0：用去离子水代替复合饮料的吸光度。

总还原力的测定：采用铁氰化钾还原显色法[19]。将0.2 mL不同质量浓度的复合饮料置于试管内，按顺序添加0.2 mol/L的磷酸钙缓冲液1.0 mL和1%的铁氰酸钾1.0 mL，在50 ℃下热水浴20 min，然后添加1.0 mL 10%三氯醋酸溶液，使该反应过程终止，在4 ℃下3000 r/min离心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸馏水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，混和均匀后静置15 min，在700 nm波长处测定吸光值A1，用蒸馏水取代复合饮料样品液，测定吸光值A2。采用相对应浓度的维生素C作为对照，每个条件下的实验都重复测定三次。总还原力按公式(4)计算。

总还原力 =A1-A2

(4)

式中，A1：复合饮料的吸光度；A2：蒸馏水取代复合饮料的吸光度。

1.10 数据处理

每组样品试验做3次平行，图表的绘制分别采用Origin 2022和Excel软件，利用IBM SPSS 25.0对其进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酶添加量对桑葚、蓝莓原汁中花色苷含量影响

如图1，酶添加量为0.02%-0.06%时，桑葚、蓝莓的花色苷溶出量增速较快，在酶添加量为0.06%时，二者均达到最大值，其中花色苷含量：桑葚(52.08±0.36) mg/L，蓝莓(313.67±0.35) mg/L。当果胶酶添加量超过0.06%后，花色苷的溶出量逐渐下降，这是过量的果胶酶使花色苷的糖苷键水解断裂导致的[20]。研究表明，部分果胶酶具有β-糖苷酶和肉桂酸酯酶活性，从而使花色苷去糖基化形成不稳定的花色苷元，也会使花色苷的含量降低[21]。

2.2 酶解温度对桑葚和蓝莓花色苷含量的影响

如图2所示，在20-60 ℃的酶解温度范围内，桑葚和蓝莓花色苷含量变化趋势相一致。在30 ℃之前，桑葚和蓝莓花色苷含量随酶解温度升高而增加，在30 ℃时二者均达到最大值，其中桑葚(76.148±1.28) mg/L，蓝莓(278.14±2.28) mg/L。温度大于30 ℃时，花色苷的溶出速率出现了明显的降低，这是因为温度升高，花色苷的分解速度加快，稳定性降低。研究显示将桑葚花色苷分别在60 ℃、80 ℃和100 ℃恒温下保存4 h，对其花色苷降解率进行测定，发现60 ℃时花色苷降解率最小，随温度升高花色苷严重降解[22]。测定冻干野生蓝莓粉在25、42、60、80 ℃ 4个不同温度下花色苷的稳定性，发现在25 ℃时花色苷的稳定性最好[23]。

图1 不同酶添加量的桑葚、蓝莓原汁中花色苷含量

图2 不同酶解温度的桑葚、蓝莓原汁中花色苷含量

2.3 酶解时间对桑葚、蓝莓花色苷含量的影响

如图3所示，酶解时间范围为30-150 min时，花色苷含量随酶解时间的延长先升高后降低，在120 min时花色苷含量达到最大值，其中桑葚(77.48±1.35) mg/L，蓝莓(295.76±1.68) mg/L。本实验中花色苷含量随酶解时间的变化趋势与Buchert等的研究结果相一致[24]。在120 min时，酶解过程基本完成，当花色苷的含量达到最大时，随着时间的增加，因其不稳定而发生氧化分解，使其溶解速率降低，可能是由于长时间的氧或光照直接促进了花色苷的降解[25-26]。

图3 不同酶解温度的桑葚、蓝莓原汁中花色苷含量

2.4 不同比例的桑葚蓝莓原汁对复合饮料感官评分的影响

不同比例桑葚蓝莓原汁对感官评分的影响如图4所示。在桑葚、蓝莓原汁比例为3∶2时，各项感官评分最高。桑葚原汁比例过低或过高其感官评分都有所降低，是由于桑葚原汁或蓝莓原汁过多会掩盖对方的香气风味，导致风味缺失，引起口感不适。

图4 不同比例桑葚、蓝莓原汁对复合饮料感官评分的影响

2.5 柠檬酸添加量对复合饮料感官评分的影响

柠檬酸是一种有机酸，可以适量添加于饮料中，具有提升口感的作用。如图5所示，柠檬酸的添加量在0.15%时，复合饮料酸甜可口，表现出较好的口感，各项感官评分均为最高。添加量大于或小于0.15%时，复合饮料的感官评分均呈现下降趋势，其原因为柠檬酸的添加导致复合饮料糖酸比例失调，饮料表现出过酸和酸味缺失的状况，致使口感不佳。

2.6 蔗糖添加量对复合饮料感官评分的影响

在饮料中添加蔗糖不仅可以增加饮料的甜度，而且可以掩盖饮料中的涩味。如图6所示，在蔗糖添加量为8%时，复合饮料的感官评分最高，添加量高于8%时，饮料甜度过大，掩盖复合饮料所特有的风味，导致口感不佳。添加量低于8%时，复合饮料的酸涩味突显出来，引起口感不适，使各项感官评分有所降低。

图5 柠檬酸添加量对复合饮料感官评分的影响

图6 蔗糖添加量对复合饮料感官评分的影响

2.7 复合饮料配比正交优化实验结果

如表5所示，通过对比分析得出最优组合为A1B1C2D2，即桑葚原汁添加量60 mL，蓝莓原汁添加量40 mL，柠檬酸添加量0.15%，蔗糖添加量8%。通过R值的比较得出各个因素对复合饮料的感官品质影响依次为A> B>C>D，即桑葚原汁的添加量对复合饮料的影响是最大的，其次是蓝莓原汁的添加量、柠檬酸的添加量，蔗糖的添加量对复合饮料的影响最小。

表5 复合饮料正交实验结果

续表

比较表5中数据可得，在9个试验结果中试验1和2的分数最高，但二者差异不显著；正交试验所得最优组合是A1B1C2D2，因此需要进行验证试验来确定最终的水平组合。验证试验得出，组合A1B1C2D2的复合饮料感官评分最高，为(94.5±2.14)分，因此认为A1B1C2D2为最优配方。

2.8 桑葚蓝莓复合饮料对DPPH自由基的清除率

DPPH是一类重要的自由基，其主要作用是研究其抗氧化性。其原理是以DPPH的脱色为基础，通过将DPPH溶液与供氢体进行混合，使其苦味醇肼基(紫色)还原为苦味醇肼(淡黄)[27]。DPPH的还原性能取决于它在517 nm处的吸收率。由图7可知，DPPH自由基清除能力随着复合饮料浓度的增大而增强。在20-60 ug/mL的复合饮料中，其DPPH自由基清除率显著提高。维生素C对DPPH的清除能力始终很强。在100 ug/mL的质量浓度下，复合饮料与维生素C对照组均能最大限度地清除DPPH，清除率分别为 (87.48±1.26)%和(94.14±1.62)%，此时，复合饮料的清除能力达到维生素C清除率的92.93%，具有与其相当的抗氧化能力。

图7 不同浓度桑葚蓝莓复合饮料和维生素C的

2.9 桑葚蓝莓复合饮料对ABTS自由基的清除率

从图8可以看出，在相同的质量浓度下，复合饮料的ABTS的清除能力一直低于维生素C。随着质量浓度的增大，复合饮料与维生素C对照组的ABTS清除率逐渐升高，复合饮料的增大幅度大于维生素C。当质量浓度在20-60 ug/mL之间时，对ABTS来说，复合饮料与维生素C对照组清除能力差距较大，但随着质量浓度的增加两者之间的差值越来越小。复合饮料清除率在质量浓度为100 ug/mL时达到最大为(75.78±1.4)%，达到维生素C清除率的80.02%，说明该复合饮料已经具有较好的抗氧化能力。

图8 不同浓度桑葚蓝莓复合饮料溶液和维生素C的

2.10 桑葚蓝莓复合饮料总还原力的测定

还原能力越强，抗氧化活性越强[28]。从图9可以看出，当质量浓度增大时，复合饮料和维生素C的还原能力均提高。复合饮料的还原性能比相同质量浓度维生素C的要差。在60-100 ug/mL的质量浓度下，该复合饮料的还原能力增幅较大，在100 ug/mL的质量浓度下，复合饮料的还原力达到最大为(1.024±0.02)，达到同等质量浓度维生素C还原力的83%，具有较好的抗氧化能力。

图9 不同浓度桑葚蓝莓复合饮料

3 结论

采用单因素以及正交实验确定桑葚蓝莓复合饮料制备的最佳工艺，即复合果胶酶前处理桑葚蓝莓原汁，酶解时间120 min、酶添加量0.06%、酶解温度30 ℃时，桑葚蓝莓花色苷溶出量最高。最佳复配比例为桑葚蓝莓原汁每百毫升比例为3∶2，柠檬酸添加量0.15%、蔗糖添加量8%，所制备的复合饮料口感润滑，澄清度高，感官评分最高为(94.5±2.14)分。其DPPH、ABTS自由基清除率、总还原力分别达到同质量浓度维生素C的92.92%、80.02%、83%，说明该复合饮料具有较好的抗氧化活性。本研究不仅为富含花色苷功能性饮品的开发提供了理论依据和方法基础，而且为桑葚蓝莓资源的高效利用提供了技术支持。